移植低氧预处理MSC对CKD大鼠肾功能的影响及机制

邵丽诗，邢艺苑，2，罗成诚，杨力 ，马逸群，万珊杉 ，王家平

1 昆明医科大学第二附属医院影像科，昆明650500；2 郑州市疾病预防控制中心内科；3 云县人民医院泌尿外科；4 昆明医科大学解剖学与组织胚胎学系；5 云南昆钢医院 大理大学第七附属医院影像科

慢性肾脏病（CKD）是一种进行性肾功能恶化疾病，目前，尚无有效治疗方法。间充质干细胞（MSC）具有自我更新、多分化潜能性和分泌细胞因子的特性，可通过细胞融合、分化和旁分泌信号传导等多种机制修复受损肾脏［1］。由于MSC能归巢到受损部位的数量较少，且受损组织局部缺血、炎症、缺氧和氧化应激等导致MSC 存活率低，限制了其应用［2］。低氧预处理MSC（HP-MSC）能有效提高细胞存活率和分泌能力［3］。低氧还可通过调节低氧诱导因子提高MSC 活性和促血管生成潜能［4］。基质细胞衍生因子1（SDF-1）是一种干细胞趋化因子，能通过与其特异性受体4（CXCR）结合促使MSC 迁移至损伤部位，因而SDF-1-CXCR4 信号轴对MSC 归巢至受损组织至关重要［5］。研究发现，短期低氧预处理可增加MSC表面CXCR4 的表达，而且HP-MSC 能更有效减轻肾缺血/再灌注损伤［6］。然而，HP-MSC 对 CKD 的影响以及SDF-1-CXCR4 通路在该过程中发挥的作用仍不明确。2016 年 1 月—2017 年 3 月，本研究观察HP-MSC 对CKD 大鼠肾功能的影响，并探讨其可能的作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 58 只雄性SD 大鼠，100～120 g，5～6 周，购自四川大学实验动物中心，SCXK（川）2018-026，于动物安置标准设施中饲养，温度24 ℃，光/暗循环时间12 h，每日更换垫料、饲料和水。所有实验操作均符合昆明医科大学实验动物伦理学要求。胎牛血清FBS（美国Sigma 公司）；EDTA（美国Amresco Hualcyuan biotechnology 公司）；阿霉素（ADR，美国Sigma 公司）；PT-PCR 逆转录试剂盒（中国Invitrogen 公司）；荧光定量PCR 试剂盒（日本Takara 公司）；TRIzol Reagent（中国Invitrogen 公司）；兔抗大鼠SDF-1（美国Santa Cruz 公司）；山羊抗兔IgG（美国Santa Cruz 公司）；兔抗大鼠CXCR4（中国博士德公司）；5%CO2培养箱（中国HERACELL 公司）；冰冻切片机（德国Leica公司）；GDST600凝胶扫描系统（英国UVP 公司）；SDS-PAGE 电泳槽（英国Bio-Rad公司）；PCR仪（美国Agilent公司）；核酸蛋白分析仪（美国Beckman）。

1.2 MSC的分离与培养 取2只12周龄SD大鼠颈椎脱臼处死，剥离股骨及胫骨，用含10% FBS 的DMEM 反复冲洗大鼠胫骨和股骨的骨髓，经无菌滤网过滤冲洗得到细胞悬浮液，收集细胞，2 000 r/min离心30 min，离心半径8 mm，加入PBS 溶液，1 600 r/min 再次离心10 min，离心半径8 mm，获取MSC。收集细胞，将其置于含细胞生长液和抗生素的培养瓶中，于37 ℃、5%CO2的培养箱培养；更换培养基去除非黏附细胞，保留呈梭形形态的贴壁细胞。取传至第四代的MSC 用CD29/CD45/CD11b/CD90 特异性抗体孵育，用流式细胞仪分析MSC的表面抗原。

1.3 动物分组及模型构建 将56 只大鼠适应性饲养1 周，随机分为模型组40 只、假手术（Sham）组12只、对照组4 只。模型组于腹腔注射2%戊巴比妥（0.2 mL/100 mg）麻醉，取俯卧位固定，于左侧肋脊角切口进入腹腔，切除左侧肾脏，止血后逐层缝合包扎创口，4 周后经尾静脉注射 ADR（2.5 mg/kg），1 周后再次给予相同剂量ADR构建CKD模型；对照组于相同部位注射等体积生理盐水；Sham 组做左侧肋脊角切口，随后缝合包扎，于相同部位注射等体积生理盐水。造模成功后将模型组40只大鼠随机分为CKD组4 只及ADR（ADR）组、干细胞移植（MSC）组、低氧预处理干细胞移植（HP-MSC）组各12 只。将CKD组、对照组大鼠颈椎脱臼处死，取肾脏组织待测。

1.4 移植MSC 取部分MSC 在常氧环境［37 ℃、5%CO2、95%空气环境（含大约21%O2）］中培养；另取部分MSC 在低氧环境（37 ℃、5% CO2、2%O2、93%N2）中培养。24 h后加入抗体，用流式细胞术检测细胞表面CXCR4表达。取以上处理后的（1×106/mL）细胞悬液各2 mL，分别经右肾动脉注射入MSC组、HPMSC组，Sham组、ADR组注射L-DMEM培养液2 mL。

1.5 生化指标检测 MSC 移植第1、7 天，于代谢笼中收集 24 h 尿液样本，取 5 mL 尿液，3 000 r/min 离心5 min，离心半径8 mm，去除沉淀。收集尿液的过程中，大鼠自由饮水，但不进食。另外，经内眦静脉采血3～5 mL，3 000 r/min离心l0 min，离心半径6.5 mm，取上清液。用全自动生化分析仪测定PRO、Hb、ALB、BUN、SCr。

1.6 肾脏组织病理变化观察 采用HE 染色法。分别于MSC 移植第1、7 天后，从各组各自抽取4 只大鼠，经颈脱臼处死，迅速取出肾脏分离成若干小块，用4%多聚甲醛固定过夜后，石蜡包埋制作成4 μm 的石蜡切片，进行 HE 染色，于 400 倍光学显微镜下观察拍片。

1.7 肾脏组织中SDF-1 mRNA 表达检测 采用RT-PCR。取CKD 组和正常组肾脏组织研磨离心，TRIzol 法提取总RNA，根据说明书提取总RNA，反转录合成cDNA 后进行聚合酶链式反应。根据PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应。PCR 反应体系25 μL，cDNA 0.2 μg，上、下游引物各1 μL，2 X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，RNase-free Water 8.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 40 个循环，72 ℃ 延伸5 min，然后用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR 扩增产物。以 GAPDH 为内参基因，用 2-ΔΔCt法计算 SDF-1 RNA 的相对表达量。SDF-1 上游引物序列5'-AAGGTCTGCGCTGTGCTG-3'，下游引物序列5'-CTCAGGCTGGCTTACC-3'；GAPDH 上游引物序列 5'-TGCTGGCTGGCTGCTCTC-3'，下游引物序列5'-ATGAGGTCCCACCCCTGTTGC-3'。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料用表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSC 特性鉴定结果及 CXCR4 的表达 MSC 形态均一呈梭形，鱼群样分布，旋涡状生长。流式细胞仪显示MSC 高表达CD29（99.8%）、CD90（99.4%），而低表达 CD11b（0.25%）、CD45（0.13%）。常氧MSC 及 HP-MSC 的 CXCR4 表达率分别为（26.80 ±1.57）%、（15.74 ± 1.03）%。HP-MSC 的 CXCR4 表达率高于常氧MSC（P＜0.01）。

2.2 各组生化指标比较 见表1。

表1 各组移植第1、7天生化指标比较（）

表1 各组移植第1、7天生化指标比较（）

注：与ADR组同一时间点比较，#P＜0.05；与MSC组同一时间点比较，△P＜0.05。

ALB（g/L）PRO（mg/24 h）Hb（g/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）组别Sham组移植第1天移植第7天ADR组移植第1天移植第7天MSC组移植第1天移植第7天HP-MSC组移植第1天移植第7天25.89±0.95#24.59±1.76#143.25±0.67#144.18±0.33#32.77±0.26#33.32±0.50#2.44±0.35#2.46±0.25#32.88±1.10#34.66±0.23#45.86±3.65 54.91±2.90 113.63±0.57 102.19±0.31 29.46±1.62 22.86±1.20 6.49±0.91 7.22±0.17 75.18±0.61 90.4±0.44 46.43±5.19 39.37±1.93#114.28±0.40 109.29±0.83#29.21±0.89 25.59±1.02#6.39±0.05 5.48±0.27#74.38±0.84 86.92±0.49#74.04±0.98 70.38±0.43#△46.69±2.90 30.59±4.38#△115.27±0.50 110.65±1.48#28.90±0.57 27.24±0.71#△5.96±0.35 3.55±0.97#△

2.3 各组肾脏组织病理变化比较 HE染色结果显示，Sham 组肾小球和肾小管形态正常，ADR 组肾小球局灶节段性硬化，肾小管严重萎缩，肾小球系膜细胞和基质呈不同程度增生，肾间质明显纤维化。移植第7 天，MSC 组与HP-MSC 组肾脏组织损伤减轻，MSC 组肾小球尚可见局灶节段硬化，HP-MSC 组肾小球袢扩张；与MSC 组比较，HP-MSC 组肾间质纤维化改善更明显，炎症反应更轻。

2.4 对照组与CKD 组肾组织SDF-1 mRNA 表达比较 对照组与CKD组肾组织SDF-1 mRNA相对表达量分别为1.01±0.06、1.41±0.14。与对照组比较，CKD组肾组织SDF-1 mRNA相对表达量高（P＜0.05）。

3 讨论

研究证实，MSC 通过发挥抗炎、抗纤维化和促进血管生成等作用修复肾脏［7］，但MSC 的治疗效果一直受限于较差的生存率和归巢率。MSC 随着传代次数的增加，纯度越高，细胞贴壁生长越快，但细胞表面CXCR4 的表达量却逐渐降低，进而降低了MSC 对SDF-1的靶向迁移作用。本研究在移植前通过低氧预处理激活MSC。本研究肾功能指标检测证实，用ADR 成功地诱导了大鼠慢性肾损伤，CKD大鼠的 PRO、BUN 和 SCr 水平明显升高，且 ALB 和Hb水平降低。同时，进一步观察到肾脏组织的病理损害，表现为肾小球损伤，肾间质局灶状纤维化和ADR 所致其他的肾损伤的特征。本研究发现，CKD模型大鼠肾组织中SDF-1 mRNA 表达升高，这可能由于ADR 引起肾脏组织炎症反应进而刺激SDF-1表达升高。当移植 MSC 或 HP-MSC 7 天后，CKD 大鼠 PRO、BUN 和 SCr 水平降低，ALB 和 Hb 水平显著升高。病理检查结果显示，MSC 能减轻CKD 大鼠的肾损伤。与移植MSC 比较，移植HP-MSC 后大鼠PRO、BUN 和 SCr 水平更低，表明 HP-MSC 能够更好地减轻CKD大鼠肾损伤。

SDF-1 可控制细胞黏附和分泌其他因子，诱导细胞穿过血管内皮细胞［8］。当MSC 短时间暴露于低氧条件下时，这会导致CXCR4 表达增加，并改善SDF-1 介导的趋化性［9］。本研究结果也证明，HP-MSC 的CXCR4 表达率升高，说明低氧能诱导MSC 表达更多的CXCR4。此外，还有研究认为CKD肾脏组织细胞局部配体SDF-1高表达对表面高表达受体CXCR4的MSC具有定向趋化作用，并且该作用呈浓度依赖性［10］。SDF-1与CXCR4同时高表达能增强MSC 的归巢能力。本研究发现，CKD 大鼠肾组织中SDF-1 mRNA 表达高于正常大鼠。以上表明低氧预处理的MSC 通过调节SDF-1-CXCR4 轴来提高其修复肾损伤的能力。

MSC 暴露于低氧条件下与其归巢到体内受损组织缺氧微环境相似［11］。研究表明，HP有助于移植细胞的存活、增殖、分化以及提高其旁分泌能力［12］。HP-MSC 在受损肾组织中释放 TGF-β 和 IL-10 等抗炎因子，从而抑制炎症进展［13］。在增殖期，HP-MSC分泌肝细胞生长因子和血管内皮生长因子等，从而修复肾脏［14］。研究证实，在肾缺血再灌注损伤模型中，上述有益因子可促进血管再生，减少氧化应激和抑制细胞凋亡［12］。此外，PI3K、AKT、ERK 和 p38 信号通路在SDF-1诱导MSC归巢过程中也发挥重要的调控作用［15］。

本研究证实，HP-MSC 为通过调控SDF-1-CXCR4信号轴治疗慢性肾病提供了新方向。后期研究将进一步探讨低氧对MSC 的作用机制及SDF-1-CXCR4 信号轴涉及的相关保护机制，以期为MSC 治疗CKD提供新的理论依据。