子宫内膜癌组织中miR-96、FOXO1表达变化及意义

田秀芳，陈红晓，栾雅静，郭景霞

1 天津市第五中心医院妇产科，天津300451；2 天津医科大学基础医学院教学中心

子宫内膜癌（EC）是妇科常见恶性肿瘤，全世界范围内每年新发病例约50 万例，死亡病例达26 万例［1］。近年来，EC的临床治疗取得了较大发展，如新辅助化疗、免疫治疗等，改善了患者的预后，但中晚期EC 患者预后仍然较差，5 年总体生存率小于40%［2］。微小 RNA-96（miR-96）是一种小的非编码RNA调控分子，转录后调控下游基因表达，如miR-96能与PTEN、CDK1 mRNA 的3'非编码区（UTR）结合，调控基因表达，影响细胞增殖及分化等过程［3-4］。研究发现，miR-96能够促进黏附斑激酶的表达及激活，进而促进肿瘤细胞的迁移、侵袭，且与肿瘤患者的不良预后有关［5］。叉头框基因O1属于叉头盒转录因子家族成员，可以促进下游多种趋化因子的产生，调节免疫微环境中免疫细胞的构成，影响疾病的发生发展［6-7］。研究发现，在乳腺癌［8］、膀胱癌［9］等肿瘤中均发现FOXO1表达下调，从而抑制AKT信号通路的激活及肿瘤细胞增殖、恶性进展，增强肿瘤细胞对化疗药物如顺铂的敏感性。目前有关EC组织中miR-96、FOXO1 表达的报道较少。本研究探讨EC 组织中miR-96、FOXO1的表达变化及临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集 2015 年 1 月—2018 年 4 月天津市第五中心医院收治行手术治疗的120 例EC 患者的临床资料，患者年龄32～74（44.3 ± 6.1）岁；肿瘤直径≤5 cm 75 例，＞5 cm 45 例；高中分化 67 例，低分化53 例；伴肌层浸润42 例，无肌层浸润78 例；伴淋巴结转移29 例，无淋巴结转移91 例；国际妇产科联盟（FIGO）分期：Ⅰ、Ⅱ期80 例，Ⅲ、Ⅳ期40 例。纳入标准：经病理检查确诊；无放化疗药物、免疫药物等治疗史；临床资料完整，均签署知情同意书，能够配合相应检查、治疗及随访。排除标准：伴其他器官恶性肿瘤；伴子宫肌瘤等子宫良性疾病；合并严重心肺功能障碍。本研究获得医院医学伦理委员会批准（2016-10-013）。

1.2 EC 组织及癌旁组织中miR-96、FOXO1 mRNA表达检测 采用荧光定量PCR。取术中新鲜获得的（离体30 min以内）EC 组织及癌旁组织（距癌组织边缘＞5 cm），置于液氮中保存待测。检测时将组织置于液氮中研磨，离心后去除底层组织碎块，TRIzol法提取组织中RNA，并溶于DEPC 水中，微量分光光度计检测RNA 的浓度。以5 μg RNA 为模板，逆转录成cDNA。然后进行荧光定量PCR。miR-96 正向引物 序 列 5'-GCCCGCTTTGGCACTAGCACATT-3'，反向引物序列 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 正向引物序列5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，反向引物序列5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；FOXO1 正向引物序列 5'-TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3'，反向引物序列5'-CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3'；GAPDH 正 向 引 物 序 列 5'-TGATAACTGGAGTACATTTCGCC-3'，反向引物序列5'-CGGTCATAATGGGTGAGAGTCT-3'。 PCR 引 物和探针均购自ABI生物公司。反应体系20 μL：模板2 μL，正反向引物各1 μL，SYBR premix 10 μL，去离子 水 6 μL。 miR-96 及 内 参 U6 反 应 条 件 ：95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，40 个循环。FOXO1 及内参 GAPDH 反应条件：95 ℃ 4 min，95 ℃ 30 s，62 ℃1 min，72 ℃ 30 s，35 个循环。用 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.3 随访 病例确诊之日为随访开始时间，出院后以电话方式随访，内容包括患者生存状况及肿瘤控制情况等。随访至2021年4月。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验；miR-96与FOXO1 mRNA表达的相关性分析采用Pearson 相关法；用在线软件 TargetScan 对 miR-96 与FOXO1相互作用的位点进行预测；Kaplan-Meier生物曲线法进行生存分析；多因素Cox回归分析影响EC患者预后的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC 组织及癌旁组织中miR-96、FOXO1 mRNA表达比较 EC 组织及癌旁组织中miR-96 相对表达量 分 别 为 4.118 ± 1.121、1.115 ± 0.383，FOXO 1 mRNA 相对表达量分别为0.918± 0.140、4.682±0.841。与癌旁组织比较，EC 组织中miR-96 相对表达量高、FOXO1 mRNA相对表达量低（P均＜0.05）。

2.2 EC 组织中 miR-96 与 FOXO1 mRNA 表达的关系 癌组织中miR-96 与FOXO1 mRNA 的表达呈负相关（r=-0.611，P＜0.05）。应用 TargetScan 软件对miR-96 与FOXO1 mRNA 相互作用位点进行预测，结果发现，FOXO1 mRNA 的 3'UTR 区第 232～266碱基位置处存在与miR-96相互结合的潜在位点。

2.3 miR-96、FOXO1 mRNA 表达与 EC 患者临床病理特征的关系 miR-96、FOXO1 mRNA 表达与EC的 FIGO 分期、伴淋巴结转移有关（P均＜0.05），与EC患者年龄、肿瘤直径、浸润深度、分化程度无关（P均＞0.05）。见表1。

表1 miR-96、FOXO1表达与EC患者临床病理特征的关系

2.4 miR-96、FOXO1 mRNA 表达与 EC 患者预后的关系 随访5～36（27.7 ± 6.3）个月，随访期间死亡26 例，无失访病例。以miR-96 相对表达量的均数4.118 为临界值，分为miR-96 高表达组65例，miR-96 低表达组 55 例。miR-96 高、低表达组 3年总体生存率分别为64.6%（42/65）、94.5%（52/55），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

以FOXO1 mRNA 相对表达量的均数0.918 为临界值，分为 FOXO1 高表达组 62 例，FOXO1 低表达组58 例。FOXO1 高、低表达组3 年总体生存率分别为93.5%（58/62）、62.0%（36/58），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 影响EC 患者预后的因素 以EC 患者随访过程中的生存情况为因变量（1 为死亡，0 为存活，t 为生存时间），纳入年龄（赋值：1 为≥60 岁，0 为＜60岁）、肿瘤大小（赋值：1 为≥5 cm，0 为＜5 cm）、肌层浸润（赋值：1 为有，0 为无）、分化程度（赋值：0 为高分化，1 为中低分化）、肿瘤分期（赋值：1 为Ⅲ、Ⅳ期，0为Ⅰ、Ⅱ期）、淋巴结转移（赋值：1 为伴淋巴结转移，0为无淋巴结转移）、miR-96（赋值1为高表达，0为低表达）、FOXO1（赋值1为低表达，0为高表达）为自变量。经多因素Cox 回归分析结果显示，miR-96 高表达、FOXO1 低表达、高FIGO 分期及淋巴结转移是EC 患者预后不良的危险因素。见表2。

表2 影响EC患者预后的多因素Cox比例风险回归模型

3 讨论

研究发现，miR-96 在乳腺癌、宫颈癌中表达升高，并通过抑制抑癌基因促进肿瘤的发生发展［10］。本研究发现，EC 中miR-96 的表达显著升高，FIGOⅢ、Ⅳ期及伴淋巴结转移癌组织中miR-96 表达升高，表明miR-96 促进EC 的发生发展。研究发现，肿瘤中缺氧微环境诱导，转化生长因子β 等因子的表达水平升高，能够增加miR-96 的稳定性，因此EC 组织中miR-96 表达上调［11］。天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）是细胞凋亡的执行者，促进细胞凋亡；miR-96能够转录后抑制半胱氨酸的Caspase-9的表达。肿瘤发生后miR-96表达上调，Caspase-9的促凋亡能力降低，导致肿瘤细胞无限增殖［12］。FEI等［13］报道，肿瘤中miR-96 的表达升高能够抑制酰肌醇蛋白聚糖-3 的表达，进而促进肿瘤细胞的迁移。本研究还发现，miR-96高表达的EC 患者3年总生存率低，并且miR-96 高表达是患者预后不良的危险因素。表明miR-96 是提示EC 患者预后的重要指标，值得临床深入研究。

FOXO 家族的代表性成员，广泛存在于无脊椎动物和哺乳动物中，发挥抑制细胞增殖、调节能量代谢和诱导细胞反应等功能［14］。近年来研究发现，FOXO1 在结直肠癌、肺癌等肿瘤中异常低表达，并作为抑癌基因，抑制肿瘤的发生发展［15］。本研究中，EC 中FOXO1 表达明显降低，且其表达与FIGO 分期、淋巴结转移有关，表明FOXO1 的低表达促进EC的发生发展。分析其机制，可能与FOXO1的抑癌作用有关。FOXO1过表达能够诱导肿瘤细胞G2/M 期的周期停滞，进而抑制肿瘤细胞增殖［16］。此外，FOXO1 表达降低后，SGK1 转录因子活性受到显著抑制，肿瘤细胞与细胞外基质无法解离，肿瘤细胞的浸润转移能力下降［17］。因此，FOXO1 可能是通过诱导细胞周期停滞和细胞外基质重塑，抑制EC肿瘤细胞的增殖、迁移。进一步研究表明，FOXO1低表达患者预后差，且FOXO1 低表达是EC 患者预后不良的独立危险因素。因此，检测EC 组织中FOXO1 的表达变化有利于预测患者的预后。本研究中miR-96 与FOXO1 表达呈明显负相关，生物信息学预测结果亦提示miR-96 与FOXO1 之间存在潜在的结合位点。表明miR-96 可能是通过调控FOXO1的表达，促进EC的发生发展。

综上所述，EC 组织中miR-96 表达上调，而FOXO1 表达下调，两者表达呈负相关，并且与肿瘤FIGO 分期、淋巴结转移有关，miR-96 可能通过调控FOXO1 的表达，参与EC 的疾病进展过程。EC中miR-96 高表达、FOXO1 低表达、肿瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴结转移是患者不良预后的危险因素。检测EC组织中miR-96、FOXO1 的表达对评估EC 发生发展及预后有重要意义。