miR-23c对滋养层细胞增殖、侵袭及迁移的影响及作用机制研究

夏爱华 徐平 高添艺 姜邦蓉 潘雪华 李剑兰

子痫前期（preeclampsia，PE）是一种由母体、胎儿和环境因素引起的妊娠期特有的多因素疾病，其临床特征表现为妊娠20周后新发异常的高血压（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（≥300 mg/24 h）。研究显示，滋养层细胞浸润不充分和螺旋动脉重塑失败所致胎盘化不足是PE发病的关键因素[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）通路与细胞增殖、迁移密切相关，抑制PI3K/Akt通路活性可导致胎盘绒毛细胞滋养层和合胞滋养层细胞迁移和浸润能力受限而诱发PE[2]。第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）基因是一个肿瘤抑制基因，可负调控PI3K/Akt通路抑制癌细胞增殖，同时，PTEN基因的转录后水平也受多种microRNA（miRNA）调控[3]。本课题组前期预实验发现，miR-23c在PE患者和健康者之间存在差异表达，经TargetScan数据库预测miR-23c可与PTEN 3'UTR结合，提示miR-23c可能通过调控PTEN/Akt通路参与PE进程。故本研究选取滋养层HTR8/SVneo细胞为研究对象，探讨miR-23c对PTEN/Akt通路的调控机制以及对滋养层细胞增殖、侵袭和迁移的影响，以期进一步揭示PE发生的分子生物学机制，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2019年4月至2020年8月在北海市人民医院行常规产前检查的孕妇70例，纳入标准：（1）孕妇临床资料完整；（2）年龄 20～35 岁；（3）单胎妊娠的初产妇。排除标准：（1）多胎妊娠；（2）合并自身免疫性疾病、肝肾脏疾病、糖尿病、原发性高血压及精神疾病者；（3）胎儿为试管婴儿；（4）医学或非医学妊娠丢失；（5）中途退出研究。其中PE者35例（PE组），年龄（29.71±3.05）岁；正常者 35例（正常组），年龄（28.83±2.74）岁。两组对象年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），均于分娩前抽取静脉血3 ml，于分娩后留取胎盘组织进行研究。本研究经医院医学伦理委员会批准，两组对象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要材料和试剂 人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞购于美国ATCC细胞库。RPMI 1640培养基、FBS购自美国 Gibco公司；TRIzol、逆转录试剂盒、Realtime PCR试剂盒购自日本Takara公司；Opti-MEM、Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自北京索莱宝公司；Transwell小室、Matrigel Matrix 基质胶购自美国 BD 公司；Akt、p-Akt、PTEN、βactin、羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司；pmirGLO载体、PTEN 3'UTR-WT及 MUT、miR-23c模拟物（miR-23c mimic）及阴性对照（mimic-NC）、miR-23c抑制物（miR-23c inhibitor）及阴性对照（inhibitor-NC）购自上海生工生物公司。

1.2.2 实验分组与细胞转染 取对数生长期的HTR8/SVneo细胞接种于6孔板，1×105个/孔。次日待细胞融合度达60%～70%时，采用Lipofectamine 3000进行转染，细胞分为Blank control组、mimic-NC组、miR-23c mimic组、inhibitor-NC组和miR-23c inhibitor组，共5组，Blank control组不做转染处理，其余组分别转染对应miR-23c模拟物或抑制物或其阴性对照。

1.2.3 miR-23c、PTEN mRNA、Akt mRNA 表达水平检测 采用qRT-PCR法。参照TRIzol抽提试剂盒说明书，分别从血清、胎盘组织及处理的HTR8/SVneo细胞样品中提取总RNA，依据相应的逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，获得cDNA，并以此作为模板，进行实时荧光定量PCR，U6为miRNA内参，β-actin作为mRNA内参；PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，40个循环；结果按2-ΔΔCt计算各mRNA相对表达水平，实验重复3次。引物由华大基因合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.4 Akt、PTEN蛋白表达水平检测 采用Western blot法。RIPA裂解经相应处理的HTR8/SVneo细胞提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，蛋白变性后取40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干法转移蛋白至PVDF膜，于微量震荡仪上轻轻震荡，以5%脱脂奶粉TBST室温下封闭2 h。分别孵育相应Akt、p-Akt和PTEN蛋白及β-actin蛋白一抗，4℃孵育过夜，TBST振摇洗膜5 min×6次，孵育羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗，室温1 h，TBST振摇洗膜5 min×6次。ECL底物化学发光显色后机器扫描存盘，以Image软件进行条带分析，实验重复3次。

1.2.5 细胞活性检测 采用CCK-8法。按实验分组分别转染细胞培养24 h，胰酶消化各组细胞制备细胞悬液并计数，调整浓度为 4×104/ml，分别吸取 100 μl细胞悬液接种于96孔板，每组设置4个复孔，置于细胞培养箱中培养。于培养后48 h检测细胞增殖情况。培养结束后，每孔添加10 μl CCK-8溶液，置于细胞培养箱孵育2h，用酶标仪于450nm波长处测定OD值。实验重复3次，计算细胞活性。细胞活性=（OD实验组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）。

1.2.6 细胞迁移情况检测 采用细胞划痕实验。取对数生长期的细胞接种于6孔板（4×105个/孔）正常培养，细胞融合约90%时，按实验分组分别转染miR-23c模拟物或抑制物及其阴性对照。用200 μl灭菌枪头垂直于孔底划痕，PBS漂洗至划痕处无细胞残留，于倒置显微镜下拍照，后将细胞置于细胞培养箱中正常培养，24 h后再次拍照，分析细胞迁移情况，细胞迁移率=（T0h面积-T24h面积）/T0h面积×100%，实验重复3次。

1.2.7 细胞侵袭情况检测 采用Transwell实验。取100 μl稀释好的基质胶铺于Transwell小室上表面，于37℃、5% CO2培养箱中放置6 h。转染24 h后的各组细胞用无血清培养基重悬计数，调整浓度为1×105/ml，分别取200 μl细胞悬液于上室，下室加600 μl完全培养基。培养24 h后，用棉签轻轻拭去小室上层未浸润过底膜的细胞和基质胶。4%多聚甲醛固定和结晶紫染色，至于倒置显微镜下，随机选取5个视野拍照并计数侵袭细胞。

1.2.8 miR-23c对PTEN靶向作用验证 采用双荧光素酶报告实验。将HTR8/SVneo细胞用含10% FBS的RPMI1640培养基置于37℃、5% CO2培养箱中培养。将野生型的PTEN基因3'UTR（PTEN 3'-UTR WT）及其突变体（PTEN 3'-UTR MUT）构建到pmirGLO载体中，获得pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT，不含任何外源片段的空载体作为阴性对照。pmirGLO载体的萤火虫荧光素酶luc2作为主要报告基因，海参荧光素酶hRluc-neo为对照报告基因，按照Lipofectamine 3000脂质体说明书进行转染，将miR-23c mimic分别与pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT转染到细胞中，同时以mimic-NC作为对照。设置3个复孔，转染后培养12 h，用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性，以海参荧光素酶hRluc-neo的活性作为校正报告基因。

2 结果

2.1 PE组与正常组血清、胎盘组织中miR-23c表达水平比较 与正常组相比，PE组血清及胎盘组织中miR-23c表达水平均显著降低（均P＜0.05），见表2。

表2 PE组与正常组血清、胎盘组织中miR-23c表达水平比较

2.2 各组细胞miR-23c表达水平比较 与Blank control组相比，miR-23c mimic组miR-23c表达水平显著升高（P＜0.05），miR-23c inhibitor组 miR-23c表达水平显著降低（P＜0.05），Blank control组与 mimic-NC组、inhibitor-NC组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表 3。

2.3 各组细胞活性、侵袭数及迁移率比较 与Blank control组相比，miR-23c mimic组细胞活性显著增强（P＜0.05），侵袭数显著增加（P＜0.05），迁移率显著升高（P＜0.05）；而 miR-23c inhibitor组细胞活性显著减弱（P＜0.05），侵袭数显著减少（P＜0.05），迁移率显著降低（P＜0.05）。Blank control组与mimic-NC组、inhibitor-NC组细胞活性、侵袭数及迁移率比较差异均无统计学意义（均 P ＞0.05），见表 4、图 1-2。

表4 各组细胞活性、侵袭数及迁移率比较

图1 各组细胞Transwell实验所见（×100）

图2 各组细胞划痕实验所见（×40）

2.4 各组细胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表达水平比较与Blank control组相比，miR-23c mimic组p-Akt/Akt水平显著升高（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表达均显著降低（均 P＜0.05）；miR-23c inhibitor组 p-Akt/Akt水平显著降低（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表达均显著升高（均P＜0.05）。Blank control组与mimic-NC组、inhibitor-NC组p-Akt/Akt水平及PTEN mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），各组Akt mRNA和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表5、图3。

图3 各组细胞磷酸酶与张力蛋白同源物（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）蛋白表达电泳图

表5 各组细胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表达水平比较

2.5 miR-23c对PTEN的靶向作用 在转染pmirGLOWT质粒的细胞中，与mimic-NC相比，miR-23c mimic显著降低了荧光素酶活性（P＜0.05）；在转染pmirGLOMUT质粒及空载质粒的细胞中，miR-23c mimic与mimic-NC均未明显降低荧光素酶活性（均P＞0.05），表明miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低PTEN基因的表达，见图4。

图4 双荧光素酶报告实验检测结果（PTEN为磷酸酶和张力蛋白同源物；*P＜0.05）

3 讨论

PE是一种妊娠期特有的疾病，其发病机制复杂，目前研究表明妊娠时滋养层细胞迁移和浸润不足是诱导PE的关键因素。滋养层细胞侵入动脉壁异常，导致子宫螺旋动脉由小直径向大直径血管转换受阻，进而导致胎盘血流灌注不足诱发PE；正常妊娠时，滋养层细胞不仅侵袭蜕膜，还侵袭肌肉层参与胎盘形成，滋养层细胞缺失和浸润不足导致胎盘浅埋也是PE发病的关键，表明滋养层细胞增殖侵袭和迁移在PE的发病过程中至关重要[1]。滋养层细胞的迁移和侵袭受到多种因素影响，目前尚未清楚确切分子机制。研究表明，miRNA通过影响滋养层细胞增殖、侵袭参与PE的发病过程[4]。本研究检测发现PE患者血清和胎盘组织中miR-23c异常低表达，推测其可能在PE发病机制中起重要作用。故本研究在人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞中转染miR-23c模拟物和抑制物，探讨miR-23c对滋养层细胞增殖、侵袭及迁移的影响及调控机制。

miRNA是一种丰富的内源性非编码类RNA小分子，含18～25个核苷酸，它们通过靶向mRNA发挥降解和翻译抑制作用。越来越多的证据表明miRNA在不同的生物学过程中发挥关键作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期进展和干细胞分裂等，研究表明miRNA在许多人类疾病中异常表达，与疾病发生、发展密切相关[5]。miR-23c最早发现于结直肠癌组织且呈高表达状态[6]，可抑制肝细胞癌的增殖并诱导细胞凋亡[5]，过表达miR-23c抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与其下调异粘蛋白（metadherin，MTDH）表达有关[7]。miR-23c还可能通过靶向基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α） 抑制血管生成，调节伤口愈合[8]。上述研究表明miR-23c在细胞增殖、侵袭等过程中具有重要的调节作用。本研究将miR-23c mimic和miR-23c inhibitor分别转染HTR8/SVneo细胞，检测miR-23c对细胞的增殖、侵袭及迁移的影响，发现过表达miR-23c能增强细胞活性，促进细胞侵袭和迁移，而抑制miR-23c表达后，细胞活性、侵袭及迁移能力均显著下降，表明miR-23c具有促进滋养层细胞侵袭和迁移的作用。

PTEN作为一个重要的肿瘤抑制因子，参与调节细胞增殖、分化、代谢、凋亡和侵袭等过程。PTEN通过其磷酸肌醇磷酸酶活性将磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3）去磷酸化为磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2）来拮抗PI3K活性，进而阻碍下游的Akt磷酸化，发挥拮抗PI3K/Akt信号通路的作用[3]。PI3K/Akt信号通路对维持细胞基本过程、细胞生长、存活、死亡和代谢的完整性至关重要[9]。研究发现，激活滋养层细胞中PI3K/Akt/mTOR通路后，细胞侵袭和转移能力显著增强，抑制剂LY294002抑制PI3K活性，可导致HTR8/SVneo细胞增殖、侵袭和迁移能力减弱[2，10]。这表明PI3K/Akt通路参与滋养细胞侵袭，在PE中发挥重要作用。研究发现，miR-21 inhibitor通过增加PTEN的表达，进而降低p-Akt的水平，抑制成纤维细胞的增殖并诱导凋亡[11]。薛平平等[12]研究发现，重度PE患者胎盘组织中PTEN表达显著升高，且PTEN通过下调Akt活性降低基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和 MMP-9表达而抑制滋养层细胞的迁移。上述研究表明PTEN蛋白调节的Akt磷酸化水平在滋养层细胞增殖、侵袭和迁移的过程中具有重要的调节作用。本研究中，HTR8/SVneo细胞过表达miR-23c时，细胞内PTEN表达下调，p-Akt/Akt水平显著上调，细胞增殖、迁移能力显著增强；相反，抑制miR-23c表达时，细胞内PTEN表达上调，p-Akt/Akt水平下调，细胞增殖、迁移能力显著降低，表明miR-23c通过抑制PTEN表达促进Akt发生磷酸化，进而激活PI3K/Akt通路增强HTR8/SVneo细胞的增殖、迁移能力。

既往研究发现miR-221和miR-26a均可靶向PTEN基因，抑制其表达，增强PI3K/Akt信号通路促进细胞增殖[13-14]。Li等[15]进行微阵列分析发现PTEN基因是miR-23c潜在的靶点。为进一步确认HTR8/SVneo细胞中miR-23c与PTEN基因是否存在确切的结合活性，本研究预测并设计PTEN基因3'-UTR的野生型序列及其突变体，分别与miR-23c mimc共转染到HTR8/SVneo细胞中，运用双荧光素酶报告实验检测miR-23c对PTEN基因的靶向作用。结果显示，转染pmirGLO-WT质粒的细胞的荧光素酶活性显著降低，而转染pmirGLOMUT质粒与空载质粒的细胞荧光素酶活性无显著差异，均不能明显降低荧光素酶活性，证实miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低其表达。

综上所述，本研究发现miR-23c通过抑制PTEN的表达，激活PI3K/Akt信号通路活性，进而促进滋养层细胞的增殖、侵袭及迁移，表明miR-23c参与调控PE的发病机制，并在滋养层细胞浸润异常而导致的胎盘化不足机制中发挥有益作用。这进一步揭示了PE的发病机制，提示miR-23c有望成为PE诊断或治疗的靶标，值得进一步研究。