阿魏酸甘油酯的研究进展

刘青云 辛嘉英, 路雪纯 肖婧泓 夏春谷

(哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室1，哈尔滨 150076)(中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室2，兰州 730000)

阿魏酸(Ferulic acid，FA)，是肉桂酸家族中的一种酚类成分，作为植物细胞壁中半纤维素和木质素的一种成分以及在叶子和其他植物部分的木栓质和蜡质表面而广泛存在于整个植物界中[1]，它在322 nm处具有最大紫外吸收，可用作潜在的紫外吸收物质，使皮肤免受阳光照射，由于其优异的抗氧化、抗癌症和抗诱变活性等生理功能，阿魏酸成为一种很有前途的功能性食品、药物和化妆品的原料[2]。然而，在水和油中的低溶解度限制了它的应用，需引入亲水或疏水基团来改善其水溶性或油溶性。

阿魏酸的羧酸部分容易被生物酯酶和脂肪酶酯化和酯交换，在谷物膜中酯化为植物甾醇，在草本植物和植物茎中酯化为糖，在块茎和花中酯化为甘油[3]。阿魏酸甘油酯是阿魏酸的水溶性衍生物，包括阿魏酸单甘油酯(Glyceryl Ferulate, FG)、二阿魏酸甘油酯(Glyceryl Diferulate, F2G)和三阿魏酸甘油酯，在280～360 nm处表现出良好的紫外吸收性能，在322 nm处有最大λ值。阿魏酸甘油酯的高度共轭结构赋予其强紫外线吸收特性，酚羟基的存在赋予其抗氧化能力[4，5],是天然的紫外线过滤器和抗氧化剂。这些功能特性长期以来被认为是有价值的属性，可用作食品、健康和个人护理应用[6，7]。它通常从天然植物源(如小麦、马铃薯、百合)中提取，但是分离较困难，因为含量非常低(<0.1%)，这推进了阿魏酸甘油酯化学合成研究的开展；在以前的报告中，阿魏酸可通过化学和酶法制备，高温、反应剧烈、污染等缺点使得阿魏酸甘油酯的化学合成受到限制，与化学法相比，酶法合成具有反应条件温和、催化效率高、对映选择性高、能耗低等优点[8，9]。

注：sn-1(3)-FG表示sn-1(3)-阿魏酸单甘油酯；sn-1,3-DFG表示sn-1,3-二阿魏酸甘油酯，余同。图1 阿魏酸甘油酯的合成[11]

目前，阿魏酸甘油酯的合成途径主要有2种(图1)：一是阿魏酸与甘油(Glycerol)经过催化剂催化进行酯化反应获得[10，11]；二是阿魏酸乙酯(Ethyl ferulate，EF)和甘油经过催化剂催化进行酯交换反应获得[12，13]。本文综述了阿魏酸甘油酯酯化合成和酯交换合成的实例以及2种快速分离纯化鉴定技术，并分析了各个合成方法的优缺点，简述了其应用，为学者进一步研究阿魏酸甘油酯的相关实验提供参考。

1 酯化合成

阿魏酸对热敏感，且在一定的酸碱度条件下容易氧化，此外酰基迁移是甘油酯合成过程中常见的现象，可在碱、酸和高温等条件下发生，因此保护阿魏酸的酚羟基和温和的去保护步骤是很必要的。早在2002年，在Mitsunobu反应的温和条件下，咖啡酸的一些酯已经成功制备[14]。由于这种方法已被证明能产生羧酸酯而不是酚酸酯，Daniela等[15]利用这一反应对阿魏酸与甘油直接进行酯化，尝试了阿魏酸甘油酯的从头合成。为了只获得单甘酯，实验从R，S-酮取代甘油开始，并通过Mitsunobu方案将其转化为酚酸酯，用湿Aberlyst15去保护所产生的乙酰苯胺，在合成过程中，收获了一些关于酸的反应活性和产物收率的意想不到的结果。

通过合成单酯而不是二酯来满足获得更具亲水性的紫外滤光器的目的，Holser等[16]在较短的反应时间内成功地完成了甘油和4-甲氧基肉桂酸的直接一步反应，酯化反应在甲苯中使用对甲苯磺酸催化剂催化等摩尔量的反应物在回流条件下进行，获得产率约为20%的产物。然后对其进行表征分析，结果显示，4-甲氧基肉桂酸和甘油的伯羟基之间形成酯键，液质联用显示生成的产物是sn-1位4-甲氧基肉桂酰单甘油酯。

与化学方法相比，酶法合成阿魏酸甘油酯具有产物得率高、反应环境绿色、对映选择性高等优点。阿魏酸与甘油的酶催化直接合成也有实例，Moriyasu等[17]在二甲基亚砜溶剂体系中通过酶促酯化反应合成比阿魏酸更易溶于水的阿魏酸衍生物，还筛选了具有高催化阿魏酸与甘油酯化能力的酶制剂，最后成功地从黑曲霉的果胶酶PL中纯化出一种阿魏酸酯酶，其比活性为9.7 U/mg，实验发现较高浓度的甘油和阿魏酸产生较高量的阿魏酸甘油酯，这表明在高浓度的阿魏酸和反应产物存在下酶活性没有损失，产物经核磁共振氢谱分析确定是1-阿魏酸单甘油酯。

注：①含水量为7.5%(质量比)的甘油储罐，②泵，③阿魏酸的溶解容器，④磁力搅拌器，⑤填充有来自南极假丝酵母的固定化脂肪酶的反应器，⑥含有阿魏酸甘油酯的反应器流出物的容器，⑦烘箱。图2 一种连续合成阿魏酸单甘油酯的反应器系统[18]

在间歇反应器中，在50～90 ℃条件下，Takemasa[18]用南极假丝酵母固定化脂肪酶(Chirazyme©L-2C2)催化阿魏酸和不同含水量的甘油直接酯化得到主产物阿魏酸单甘油酯，二阿魏酸甘油酯和三阿魏酸甘油酯的量很少。实验发现，阿魏酸在较高温度和较低含水量的甘油中表现出较高的溶解度，其中含水量为7.5%的甘油进行酯化反应最受欢迎。然后构建用于连续合成的反应器系统(图2)，并稳定运行以实现430 kg/[m3-反应器(d)]的生产率，并证明了在至少6 d内以高生产率生产所需的产物，转化率没有任何降低。

近年来，离子液体因其宽的液体区域、可忽略的蒸汽压、低腐蚀性、不易燃性、可多次使用、热稳定性、可变的特异性和良好的溶剂化性质和可调节的极性等优异的性质，从而作为许多反应的催化剂和替代溶剂，使得阿魏酸甘油酯的合成更加高效和绿色，这引起了人们的极大兴趣[19-21]。在早些的时候，Sun[22]在离子体系下，通过阿魏酸与甘油的酯化反应合成1-阿魏酸单甘油酯(图3)；并取得了阿魏酸的转化率和1-阿魏酸单甘油酯的收率均为98%的好效果。这一结果表明，用离子液体代替有机溶剂，使得阿魏酸甘油酯的合成更加高效和绿色。

注：[Bmim]BF4表示1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。图3 对甲基苯磺酸催化阿魏酸和甘油在[Bmim]BF4中的酯化反应[22]

2 酯交换合成

阿魏酸甘油酯的另一种合成方式是利用阿魏酸乙酯和甘油或植物油发生酯交换反应。此法相比较于酯化合成，产率会提高，例如，Sun等[23]曾尝试通过用南极假丝酵母脂肪酶(Novozym435)催化阿魏酸和甘油来合成阿魏酸甘油酯。然而，在反应14 h后阿魏酸甘油酯的产率仅为10%，如此低的反应速率在于阿魏酸在甘油中的有限溶解。接着，改用Novozym435催化阿魏酸乙酯与甘油(摩尔比1∶10)的酯交换反应获得阿魏酸甘油酯，并比较了真空旋转蒸发、真空磁力搅拌和轨道培养箱摇动三种合成方法下阿魏酸乙酯转化率和阿魏酸甘油酯收率的大小。结果发现，在真空旋转蒸发合成方法下，阿魏酸乙酯实现全部转化，且阿魏酸甘油酯收率高达96%，这一结果归因于外部传质的消除和乙醇去除的效率；也说明相较于阿魏酸，Novozym435对阿魏酸乙酯具有更高的底物活性。产物经核磁共振氢谱和液质联用分析确定是1-阿魏酸单甘油酯。为了减少甘油的使用量，David等[24]将阿魏酸乙酯和甘油按照1∶1的比例在固定化酶的催化下合成阿魏酸单甘油酯，虽然降低了甘油的用量，但该反应时间长(7 d)，其中未知的因素会对最后的得率产生一定影响。

在上述反应中，需要通过添加大量的甘油或是延长反应时间来提高反应物的转化率和产物的得率。为了弥补缺陷，秦飞等[25]提出一种新型的具有反应时间短、反应物甘油含量低、转化率和得率均高的阿魏酸甘油酯合成路径，即在新型绿色溶剂离子液体体系中，用Novozym435催化摩尔比为1∶1.4阿魏酸乙酯和甘油的酯交换反应(图4)，并对其工艺进行优化，反应5 h后，反应物的转化率可高达99.47%。产物经高效液相色谱检测分析确定有sn-1-阿魏酸单甘油酯和sn-1,3-二阿魏酸甘油酯。

注：Novozym435表示固定化酶435；离子液体指的是1-乙基-3-甲基咪唑双[(三氟甲基)磺酰基]酰亚胺([EMIM]TF2N)，余同。图4 Novozym435催化阿魏酸和甘油在[EMIM]TF2N中的酯化反应[25]

阿魏酸甘油酯的合成有一些是在无溶剂体系下且使用各种功能化的离子液体作为催化剂进行反应的。Sun等[26]在不同功能化的离子液体(Ionic Liquids,ILs)体系中(表1)，在无溶剂体系下，阿魏酸乙酯和甘油发生酯交换反应合成1-阿魏酸单甘油酯，并以反应物的转化率、产物的收率和产物的反应选择性(产物的收率/反应物的转化率)为参考指标，选出最优离子体系。结果显示，在1-丁基磺酸-3-甲基咪唑甲苯磺酸盐([BSO3HMIM]TS)离子液体体系中，获得了较高反应物的转化率(98.0±1.5)%、1-阿魏酸单甘油酯收率(88.7±1.1)%和1-阿魏酸单甘油酯的反应选择性(90.5±2.1)%，这与SO3H-功能化离子液体在温和条件下显示出比非功能化离子液体更高的催化活性理论一致，这是因为SO3H-官能团的存在可以明显提高反应物的酸性和溶解性[27]。

表1 离子液体的名称和缩写

Sun等[28]考察了工艺参数(反应温度、酶浓度和底物浓度比)和动力学常数对在1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)离子体系中用固定化脂肪酶Novozym435催化阿魏酸乙酯与甘油的酯交换反应的影响。结果显示，在[BMIM]PF6离子体系中，在80 ℃、Novozym435浓度为60 mg/mL、反应物摩尔比为1∶1时，阿魏酸甘油酯(sn-1-阿魏酸单甘油酯和sn-1,3-二阿魏酸甘油酯)的产率最高，为(63.72±1.26)%；Lineweaver-Burk图显示EF与甘油的酶促酯交换反应符合经典的米氏动力学，较高浓度的EF和甘油均抑制酶活性。因此，酶促酯交换反应可以用Ping-Pong Bi-Bi动力学机制来模拟，动力学常数可通过上述模型的非线性回归分析获得，Vmax、KM分别为12.01 mol/(L·min)、0.23 mol/L，表明酶与阿魏酸乙酯的亲和力高于甘油；KI为1.20 mol/L，这归因于酶微环境中形成的甘油位阻层以及阿魏酸乙酯的给电子位阻和空间位阻[29,30]。

表2 离子液体的名称和缩写

虽然功能化离子液体的诸多优点使其成为新型绿色催化剂，但其黏度大、价格高的缺点也会限制它的使用；超声波辅助可以降低黏度，且反应快速，可以很好地改进这些缺点[32，33]。陈小威等[34]在无溶剂体系中，用超声波辅助固定化脂肪酶催化阿魏酸乙酯和甘油的酯交换反应，并探讨了使用超声和磁力搅拌在真空和密闭条件下，反应时间对反应物的转化率和产物的得率的影响。结果显示，在超声反应方式下反应物的转化率和产物的得率都明显优于在磁力搅拌器中的反应效果，分析其原因，超声可使酶周围的水化层变薄，从而使反应体系很好地传质，这一结果对深入研究阿魏酸甘油酯的合成提供了理论基础。

Sun等[35]研究了无溶剂体系中以Novozym435为催化剂催化阿魏酸乙酯与蓖麻油酯交换合成阿魏酸甘油酯的路线，考察了阿魏酰基供体、反应变量(酶负载量、反应时间、反应温度和底物浓度比)和乙醇去除对酯交换反应的影响(图5)。结果显示，当使用阿魏酸乙酯作为阿魏酰基供体时，反应完成后其转化率为(53.5±2.5)%，远高于阿魏酸的2%，故阿魏酸乙酯是比阿魏酸更优选的阿魏酰基供体；在乙醇去除对酯交换反应的影响中，真空条件下转换率可提高到100%，而在大气压力下转化率几乎保持相同水平，这一结果证明在真空条件下副产物乙醇的有效去除；最后该反应的最优条件为：酶负载量20%、反应时间72 h、反应温度90 ℃和底物浓度比1∶1，得到37.3%的亲水性阿魏酸甘油酯(阿魏酸单甘油酯和二阿魏酸甘油酯的总和)。

图5 酶促蓖麻油与阿魏酸乙酯酯交换合成阿魏酸甘油酯[35]

在以前酶法合成阿魏酸甘油酯时，Novozym435具有最好的催化活性，而它的高成本和甘油在其上的吸附限制了它的工业应用。为了降低生物催化剂的成本和克服Novozym435对甘油的吸附，Yao等[36]使用3种市售的游离液体脂肪酶(CAL-A、CAL-B和TL)作为催化剂，阿魏酸乙酯和甘油进行酯交换反应合成水溶性阿魏酸甘油酯，并分析了游离脂肪酶的催化性能以及评价不同阿魏酰基供体(阿魏酸乙酯和阿魏酸)、反应体系压力(大气压和真空压力)和反应变量(温度、底物比、时间和酶负荷)对产物水溶性阿魏酸单甘油酯的影响。对于酶的筛选，与CAL-A和TL相比，CAL-B表现出最佳的反应活性，即CAL-B活性高于CAL-A和TL[37]；对于阿魏酰基供体，当阿魏酸乙酯作阿魏酰基供体时，反应24 h后转化率(88.6±2.3)%高于阿魏酸(<30%)，这是因为在反应体系中，阿魏酸(174 ℃)的熔点高于阿魏酸乙酯(64 ℃)，溶解度低于阿魏酸乙酯，则以阿魏酸为阿魏酰基供体的体系中存在较大的传质限制；对于反应体系压力，在相同反应时间条件下，大气压下转化率(79.2±2.2)%是真空压力的2倍，这可能是因为大气系统中有水的存在；对于反应变量，结果显示在70 ℃，底物摩尔比为1∶10，酶负载量为11.1%，反应39.5 h后阿魏酸乙酯转化率为最高(95.7±1.2)%，阿魏酸单甘油酯收率为(84.8±1.5)%。

综上，对酯化合成和酯交换合成中应用到的有机溶剂体系、酶催化体系、离子液体体系和无溶剂体系进行综合分析，其优缺点详见表3。

表3 阿魏酸甘油酯合成过程中反应体系的优缺点

3 阿魏酸甘油酯的分离纯化及定性定量分析

在阿魏酸甘油酯合成过程中，有时会生成与阿魏酸、阿魏酸双甘油酯的混合物，可以利用各组分极性的不同来进行鉴别，鉴别方法有薄层色谱法、液体CO2萃取法、高效液相色谱法、柱层析法和分子蒸馏法等[38]。例如Sun等[23]在反应结束后，先过滤，然后用常压C18色谱柱[30 μm，(400±30)mm]分离剩余的混合物，用90%、80%、70%、60%甲醇水溶液以2 mL/min的速度连续洗脱，在320 nm处检测洗脱液，合并含有所需产物的馏分，减压浓缩至干，即可得到纯化的阿魏酸单甘油酯产物。陈小威[39]在反应结束后，将混合物进行过滤，所得滤液通过水洗得到FG，再用乙醇洗涤得到DFG。

快速色谱(Flash Chromatography)，也称为低压或中压液相色谱(25～200 psi，172～1 380 kPa)，是一种用于物质纯化的定性分离技术[40]；与用于化合物定量分离和鉴定的分析技术，如高效液相色谱或超高效液相色谱(>1 000 psi，>6 895 kPa)相对。该方法是对制备型高效液相色谱和柱色谱方法的必要改进，能够有效地处理含量约100 g的物质；而之前的方法仅可纯化毫克至低克量的阿魏酸甘油酯或用于单独分离少量的混合物。

David等[41]研究了一种中试规模(1 000 kg/年)的连续进料、填充床、酶生物反应器，该反应器采用固定化脂肪酶Novozym 435在60 ℃下将阿魏酸乙酯和植物油三酰甘油(如大豆、椰子)进行酯交换反应，在室温下放置7 d后，所得阿魏酸化植物油反应产物产生粗黄色沉淀(96.4 g，4.02%)，并利用快速色谱方法对沉淀物进行初步鉴定，结果显示，是含阿魏酸甘油酯的混合物，其中在甘油骨架上至少有一个阿魏酸部分和一个脂肪酸部分[42]。

具体操作流程为使用CombiFlash Rf 200i快速色谱系统纯化粗黄色沉淀物，该系统在325 nm处进行紫外检测，并通过改变RediSep柱尺寸、溶剂流速、溶剂梯度和粗产品样品负载来优化阿魏酸单甘油酯和二阿魏酸甘油酯的纯化。分离过程为将粗黄色沉淀物(3.0 g)溶解在丙酮(10 mL)中，并用注射器将溶液装载到12 g RediSep柱上，将其真空抽吸至干1 h用作垂直于120 g RediSep分离柱上方的装载柱，接着以57 mL/min的速度在“液体加载”模式下进行分离，首先用己烷平衡堆积柱的三柱体积(CV)，然后用0～80%丙酮/己烷二元梯度在7 CV上开发堆积柱，接着用80%丙酮/己烷二元梯度洗脱1 CV，最后用100%己烷洗脱2 CV；合并含有目标峰的溶剂收集管，通过旋蒸除去溶剂。将所得白色固体(二阿魏酸甘油酯)或黄色油状液体(阿魏酸单甘油酯)在真空(11.6 Pa)下于30 ℃干燥18 h。合并所有分离，得到:二阿魏酸甘油酯39.1 g(相对于粗黄色沉淀为40.6%)和阿魏酸单甘油酯 9.4 g(相对于粗黄色沉淀为9.8%)。

用快速色谱法处理95.0 g以上的粗副产物混合物，这与通过高效液相色谱、1H核磁共振、13C核磁共振和液相色谱-电喷雾质谱对阿魏酸甘油酯表征结果一致。阿魏酸甘油酯分别被分离为sn-1，3和sn-1位置异构体二阿魏酸甘油酯(F2G)和阿魏酸单甘油酯(FG)，并且在快速色谱纯化过程中或在储存期间没有表现出酰基的迁移。

在之前的报道中已进行了阿魏酸甘油酯中试规模的生产，如果生物反应器系统的水活度没有最小化(<250 mg/L)，或者如果反应是用单酰基甘油进行的，那么阿魏酸甘油酯的形成增加(4%～30%)，并且这些分子物质从阿魏酸化的植物油产品中沉淀出来[43]，但由于含量较低，一般的分析方法较难完成，而且分析过程中需要溶解或消耗分离出的阿魏酸甘油酯，因此需要一种快速分析方法对通过生物反应器合成从植物提取物中以毫克量或以克量分离的阿魏酸甘油酯，且不需要消耗样品。

拉曼光谱(Raman spectroscopic)相对于核磁共振、液相色谱和其他基于光谱学的检测方法，其优势是在时间上有所改进，还可以解决以毫克或克为单位的反应产物，且对粗产品样品无损失；但由于其可用性、专业知识和成本等原因，阻碍其广泛应用。David等[44]报告了一种快速、方便地使用拉曼光谱来定性阿魏酸甘油酯的技术。峰强度的比例性为物质的鉴定提供了一种额外的手段，且阿魏酸甘油酯的拉曼光谱在其峰之间具有唯一的比例性，这有助于鉴定；并选择B3LYP密度泛函计算作为理论参考，因为它成功地描述了类似分子的分子内相互作用、几何结构、紫外和拉曼光谱[45，46]。分析结果显示(图6)，二阿魏酸甘油酯在实验拉曼光谱中有4个峰，其强度从荧光中可以清楚地识别，分别在1 593 cm-1(1.0)、1 634 cm-1(0.94)、1 703 cm-1(0.47)和1 155 cm-1(0.71)处识别；对于阿魏酸单甘油酯，识别峰和比例强度分别为1 593 cm-1(1.0)、1 629 cm-1(0.74)、1 685 cm-1(0.74)和1 275 cm-1(0.82)，这些峰与密度泛函理论的计算结果一致。密度泛函理论计算的荧光光谱中强度最大的峰在1 637 cm-1，与荧光的芳香环的伸展有关，在1 668 cm-1和1 732 cm-1有两个强度较低的突出峰；1 668 cm-1处的计算峰与阿魏酸甘油酯的烯烃双键的拉伸有关，1 732 cm-1处的计算峰归因于阿魏酸甘油酯的羰基的拉伸。尽管阿魏酸单甘油酯和二阿魏酸甘油酯具有相似的官能团，并且对于具有最大强度的峰具有相似的拉曼位移，但是可以用相对强度来识别其他重要的拉曼峰，该相对强度可以在归一化光谱中很好地将其区分。

图6 阿魏酸单甘油酯和二阿魏酸甘油酯的实验拉曼光谱[44]

4 结语

目前，对于阿魏酸甘油酯的合成研究主要有两大方向，一是在不同离子液体体系下，用酶或有机溶剂催化合成阿魏酸甘油酯；另一是在研究者开发的生物反应器中，通过减少反应物甘油的用量来合成阿魏酸甘油酯。日前实验取得了一定的成果，解决了一些问题，但仍然存在需要用到有机溶剂、离子液体价格过高、反应时间较长、产物难分离等缺陷，因此，设计一种既高效、绿色，又能使用快速分离技术使其分离的实验方案，是很有必要的，随着各学科各领域的相互交叉，这一设想不难实现，也为工业化生产提供了基础。