基于疼痛抑制行为测试的青藤碱镇痛作用*

苏 漫 ，卫蒨蒨，欧云淘，周致用，唐文婷，钱珣佳，朱 清***，李俊旭

(1 南通大学药学院，南通 226001；2 湖北省武汉市红十字会医院药剂科)

疼痛尤其是慢性疼痛严重困扰着人类健康，给个人和社会都带来沉重的负担。目前临床上使用的镇痛药物，如传统的非甾体类抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)和阿片类镇痛药，常因疗效有限性及毒副作用导致在临床的应用受到限制[1]。目前用于治疗慢性疼痛患者的药物处于严重不足的状态[2]，因此对于治疗慢性疼痛的药物研发具有较高的临床需求。

目前在镇痛药物的研发上仍然没有实质性的突破[3]。有些学者[4]认为新型镇痛药物研发的临床转化效率低下，在一定程度上是因为现有的疼痛动物模型不能很好地表现出临床疼痛的症状。传统的动物模型，疼痛测量指标主要以甩尾，缩足、舔足，扭体等疼痛激发行为为主。这些行为在受到伤害性刺激后被激发，而在正常情况下发生频率很低或者不发生。这种测量方法往往无法区分药物的运动干扰效应和真实的镇痛效应[5]。近年来有学者[6]建议使用疼痛抑制行为来作为疼痛测量指标，即测量动物的一些固有行为，如摄食、自主活动、筑巢等，在受到伤害刺激后被抑制，导致频率降低而非增加。由于真正的镇痛作用可以改善疼痛引发的抑制行为，而运动功能损伤则无此效应。所以将疼痛抑制行为测量方法用于镇痛药效评价可以甄别真正的镇痛作用和运动损伤的干扰效应。另外临床上对疼痛的评价，很大程度上依赖于疼痛抑制行为的测试。因此，动物疼痛抑制行为测试有助于加快镇痛候选药物从临床前向临床的转化进程[7]。综上所述，基于疼痛抑制行为的测量方法，与传统疼痛激发行为测试互为补充，用于药物镇痛效应的评价能大大提高镇痛药物研发的预测效度。

青藤碱是来源于防己科植物青风藤的一种生物碱，结构与吗啡类似，具有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇咳、降血压及抗心律失常等多种药理作用[8]，临床上已有成品用于治疗风湿性关节炎等疾病。近年来，国内外学者[9-11]研究发现青藤碱对多种动物疼痛模型具有广泛的镇痛效应。本课题组前期研究[12-13]结果也发现青藤碱对大鼠神经病理性疼痛及切口手术后疼痛模型具有明显的镇痛效应。但是之前的研究均从疼痛激发行为的角度来观察青藤碱的镇痛效应，而青藤碱对于疼痛抑制行为是否有效目前尚不清楚，有可能导致临床上出现假阳性。本研究通过建立疼痛抑制行为的测试方法，观察青藤碱对疼痛抑制行为的改善作用，这将为青藤碱作为镇痛药物应用于临床提供更确切可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性ICR 小鼠，体质量20～25 g，由南通大学实验动物中心提供。实验室温度(22±1)℃，湿度50%～70%，12 h 光照(7:00—19:00)，实验前适应环境至少3 d，实验期间小鼠自由饮食、饮水。

1.2 药物与试剂 青藤碱与酮洛芬购于上海阿拉丁试剂公司；青藤碱用生理盐水配制，酮洛芬用1%Tween-80 溶解配制。乳酸购于北京百灵威科技有限公司，用生理盐水稀释至所需浓度。

1.3 乳酸扭体实验[14]每只小鼠腹腔注射不同浓度乳酸后，单独放置在透明的树脂观察箱中，观察20 min 内小鼠的扭体次数。扭体反应定义为小鼠腹部收缩内凹、身体与后肢伸张、臀部翘起及蠕行，作为疼痛激发行为来量化乳酸诱发的疼痛。

1.4 自主活动测试[15]小鼠的自主活动通过YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(济南延益科技有限公司,中国)记录，将小鼠放进黑色塑料暗箱内，光传感器位于暗箱内，记录小鼠30 min 内自主活动次数。

1.5 筑巢实验[16]实验前，每只小鼠单独饲养在饲养笼(320 mm×215 mm×170 mm)中，每只塑料笼中均匀放置6 个棉球适应2 d。实验中，将小鼠笼从饲养室转移到无窗实验室，500 流明光照，适应10 min，给予相应的药物处理后，立即将小鼠放回笼中，均匀放入新的棉球进行实验，观察并记录90 min 内小鼠的筑巢情况(即清除棉球的个数)。实验期间小鼠自主进食和饮水。

1.6 实验设计

1.6.1 青藤碱对乳酸扭体疼痛行为的影响 (1)乳酸扭体疼痛模型建立：小鼠分别腹腔注射生理盐水和3 个不同浓度(0.1%,0.18%,0.32%)乳酸(给药体积10 mL/kg)，观察并记录20 min 内的扭体次数。然后在最佳的乳酸浓度条件下，于不同的预处理时间(0,10,30 min)记录小鼠扭体次数。(2)青藤碱对小鼠乳酸扭体的镇痛作用：根据前期研究结果[13]选择青藤碱有效剂量30 mg/kg。皮下注射后经不同预处理时间(5,30,60,90,180,270 min) 后腹腔注射乳酸造模，观察其扭体反应。设一组为赋型剂组，即予生理盐水后乳酸造模。确定青藤碱最佳预处理时间后，研究青藤碱对乳酸扭体疼痛模型作用的剂量依赖性。于最佳预处理时间皮下注射青藤碱不同剂量(1,3,10,20,30 mg/kg)，然后给予乳酸后记录小鼠扭体次数。同时使用酮洛芬作为阳性对照药，给予4 个剂量(1,3,10,30 mg/kg)酮洛芬皮下注射，30 min 后予乳酸，记录小鼠扭体次数，比较青藤碱与酮洛芬的作用。

1.6.2 青藤碱对乳酸诱导的小鼠自主活动抑制的影响 (1)乳酸诱导的自主活动抑制模型建立：腹腔注射0.32%乳酸，经不同的预处理时间(0,30,60 min)后自主活动计数，选择最佳预处理时间。分别给予小鼠腹腔注射0.1%、0.18%、0.32%乳酸，经最佳预处理时间后自主活动次数，选择最佳乳酸浓度。(2)青藤碱对乳酸诱导小鼠自主活动抑制的影响：青藤碱不同剂量(3,10,20,30 mg/kg)预处理30 min 后，给予乳酸处理记录小鼠活动次数。在确定青藤碱最佳作用剂量后，研究青藤碱不同预处理时间(5,30,60,90,150,270 min)对0.32%乳酸所导致的自主活动抑制行为的影响。同时观察不同剂量(1,3,10,30 mg/kg)酮洛芬皮下注射30 min 后，给予乳酸小鼠30 min内的活动次数，比较青藤碱与酮洛芬对乳酸诱导小鼠自主活动抑制的影响。(3)青藤碱对正常小鼠自主活动的影响：小鼠分别给予生理盐水(赋形剂组)以及不同剂量(3,10,30 mg/kg)青藤碱预处理30 min 后，自主活动计数。

1.6.3 青藤碱对乳酸诱导的小鼠筑巢抑制的影响(1)乳酸诱导的小鼠筑巢抑制模型建立：腹腔注射0.32%乳酸不同的预处理时间(5,30,60,120 min)后记录其90 min 内筑巢情况，选择最佳预处理时间。小鼠分别腹腔注射0.1%、0.18%、0.32%乳酸，经最佳预处理时间后记录筑巢情况，选择最佳乳酸浓度。(2)青藤碱对乳酸诱导的小鼠筑巢行为抑制的影响：青藤碱不同剂量(3,10,20,30 mg/kg)预处理30 min 后，给予乳酸处理后记录小鼠筑巢情况。在确定青藤碱最佳作用剂量后，研究不同预处理时间(0,30,60,90 min)对乳酸导致筑巢抑制的影响。同样观察阳性对照药酮洛芬不同剂量(1,3,10,30 mg/kg)皮下注射30 min后，给予乳酸后记录小鼠筑巢情况，比较青藤碱与酮洛芬对乳酸诱导小鼠筑巢活动抑制的影响。

1.7 统计学方法 所有数据均以均数±标准误表示，用GraphPad Prism 5.01(San Diego,CA,USA)进行统计分析和绘图。组内时间和治疗剂量的比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间多重比较采用Bonferroni post hoc 分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 青藤碱对乳酸扭体疼痛行为的影响 生理盐水对照组小鼠扭体次数为0，仅0.32%乳酸引起扭体次数较对照组显著增加(P<0.001)(图1A)。0.32%乳酸在0 min 和10 min 预处理时间的扭体次数与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.001)，而30 min预处理时间引起的扭体反应次数与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图1B)。因此，选择0.32%乳酸预处理0 min 建立乳酸扭体疼痛模型。

在此基础上，首先观察青藤碱30 mg/kg 不同预处理时间对乳酸诱导扭体反应的影响，结果显示青藤碱预处理5 min 即起效，30 min 为最佳效应时间，至60 min 时，青藤碱镇痛作用消失(图1C)。然后选择预处理时间为30 min，观察不同剂量青藤碱对0.32%乳酸诱导的扭体反应的影响，结果显示10～30 mg/kg 的青藤碱均显著改善乳酸引起的疼痛扭体反应(P<0.05)，且这一作用呈剂量依耐性(图1D)。同时阳性对照药酮洛芬1～30 mg/kg 对0.32%乳酸引起的扭体反应均有显著抑制作用(P<0.001)(图1E)。

图1 青藤碱对乳酸扭体的镇痛作用

2.2 青藤碱对乳酸诱导的小鼠自主活动抑制的影响 0.32%乳酸在不同的预处理时间对小鼠自主活动的影响结果见图2A，预处理0、30、60 min 测定的自主活动与对照组相比均显著降低(P<0.05)；不同浓度的乳酸0 min 处理后的小鼠自主活动检测结果见图2B，仅0.32%乳酸显著降低小鼠自主活动(P<0.01)。因此，选择0.32%乳酸预处理0 min 诱导小鼠自主活动行为抑制模型。

根据前述结果，以青藤碱对乳酸扭体最佳作用时间30 min 作为预处理时间，观察不同剂量的青藤碱对乳酸诱发自主活动抑制的改善作用。结果显示只有3 mg/kg 的青藤碱与模型对照组相比差异有统计学意义(P<0.001)(图2C)，表现出明显的改善作用。图2D 显示3 mg/kg 的青藤碱预处理30～90 min 对乳酸诱导小鼠自主活动抑制均具有一定的改善作用(P<0.05)，而预处理30 min 时的作用最显著(P<0.01)，且随着预处理时间的延长改善作用逐渐减弱。同时阳性对照药酮洛芬(1～10 mg/kg)对0.32%乳酸引起的自主活动抑制均有改善作用(P<0.001)，而30 mg/kg酮洛芬改善作用不明显(图2E)。

此外，还观察了青藤碱对正常小鼠的自主活动，结果显示青藤碱3～30 mg/kg 与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)(图2F)，说明所使用剂量的 青藤碱对正常小鼠自主活动无影响。

图2 青藤碱对乳酸诱导的小鼠自主活动抑制的影响

2.3 青藤碱对乳酸诱导的小鼠筑巢行为抑制的影响 0.32%乳酸不同的预处理时间对小鼠筑巢行为的影响结果见图3A，结果显示0.32%乳酸预处理5、30、60 min，筑巢行为与对照组相比均显著降低(P<0.001)，其中预处理时间5 min 抑制情况最明显。而不同浓度的乳酸预处理5 min 后的筑巢行为检测结果见图3B，结果显示乳酸呈浓度依赖性地抑制小鼠的筑巢行为。与对照组比较，0.18%(P<0.01)和0.32%乳酸(P<0.001)均显著减少小鼠的筑巢行为，尤其是0.32%乳酸最为显著，而0.1%虽有降低趋势但无统计学意义(P>0.05)。因此，选择0.32%乳酸预处理5 min诱发筑巢行为抑制模型。

在此基础上，观察不同剂量(3,10,20,30 mg/kg)青藤碱预处理30 min 对0.32%乳酸诱发的筑巢行为抑制的影响(图3C)。20～30 mg/kg 青藤碱均显著改善乳酸诱发的筑巢行为抑制(P<0.05)，其中20 mg/kg的改善作用最显著(P<0.001)；然后观察20 mg/kg 青藤碱在预处理0、30、60、90 min 时对乳酸诱发的筑巢行为抑制的改善作用，结果发现预处理30 min 时作用差异有统计学意义(P<0.001)(图3D)。同时观察阳性对照药酮洛芬(1～30 mg/kg)对0.32%乳酸引起的筑巢抑制的影响，结果发现只有3 mg/kg 酮洛芬能改善筑巢的抑制(P<0.05)(图3E)。

图3 青藤碱对乳酸诱导筑巢行为抑制的影响

2.4 青藤碱与酮洛芬对乳酸疼痛模型镇痛作用比较 将青藤碱与酮洛芬对乳酸模型疼痛激发行为(扭体)以及抑制行为(自主活动与筑巢)的作用进行比较，结果如表1 所示。青藤碱对扭体的抑制率均显著低于酮洛芬，这说明青藤碱在减轻疼痛激发行为方面要低于酮洛芬的镇痛效应。青藤碱对自主活动的改善率亦显著低于酮洛芬，表明青藤碱对疼痛引起的自主活动抑制的改善作用要低于酮洛芬。筑巢恢复率对比结果显示，在3、10、30 mg/kg 时青藤碱无显著改善作用，在20 mg/kg 时对筑巢的恢复率为64.1%，而酮洛芬在1、10、30 mg/kg 无显著改善作用，在3 mg/kg 时筑巢恢复率为49.2%。这说明青藤碱对疼痛引起的筑巢抑制的恢复作用要优于酮洛芬。

表1 青藤碱与酮洛芬对乳酸模型疼痛激发行为以及抑制行为的作用比较%

3 讨 论

目前，疼痛抑制行为测试用于动物疼痛模型研究受到越来越多的关注和认可，如利用各种疼痛模型诱发摄食[17]、自主活动[18]、糖精偏爱[19]、轮跑运动[20-21]、挖掘[22-24]以及筑巢等行为[14,16]的抑制作为疼痛的判断指标，并运用于药效的评价。有学者[25]认为，这些疼痛抑制行为的测试可能会成为临床前疼痛研究实验室的标准方法。本研究首先建立疼痛抑制行为的测试方法作为疼痛评价的指标，参考文献[14,16]选择乳酸腹腔注射导致内脏痛模型来诱发扭体反应(疼痛激发行为)和自主活动及筑巢行为的抑制(疼痛抑制行为)。在乳酸扭体模型建立的过程中，发现只有0.32%的乳酸且预处理时间为0 min 时(即给予乳酸后立即观察)显著性激发扭体行为，一旦≥30 min则扭体反应几乎消失，说明疼痛激发行为维持时间较短。同时，观察了乳酸腹腔注射对小鼠自主活动以及筑巢行为的影响，发现乳酸呈剂量依赖性抑制小鼠自主活动和筑巢行为，尤其0.32%乳酸作用最为显著，且在预处理时间60 min 时差异仍有统计学意义，说明疼痛抑制行为维持时间较长，和文献[16,19]结果类似。

在疼痛激发行为研究中，青藤碱(10～30 mg/kg)能剂量依赖性地减少乳酸所致的小鼠扭体次数，说明对酸注射内脏痛有良好的镇痛作用。在疼痛抑制行为研究中，青藤碱能有效改善乳酸诱导的自主活动以及筑巢行为的抑制，其最佳作用时间与改善扭体行为的最佳作用时间一致(30 min)。由于青藤碱在所用剂量范围(3～30 mg/kg)对正常小鼠自主活动并无明显影响，说明青藤碱对激发行为及抑制行为的改善并不是通过干扰小鼠的运动功能，而是由于对疼痛水平的改善，即产生确切的镇痛来发挥作用的。本研究发现青藤碱对不同抑制行为作用的最佳剂量不一致，即青藤碱改善自主活动的最佳剂量为3 mg/kg，而改善筑巢行为的最佳剂量为20 mg/kg。推测这是由于诱发不同抑制行为所需的疼痛水平是不同的。对于自主活动实验，只有0.32%的乳酸才会引起明显自主活动抑制，说明疼痛比较显著时才会抑制自主活动，轻中度疼痛水平对自主活动影响并不显著。而3 mg/kg 青藤碱能适当减少扭体反应(虽未达到统计学差异)，稍微缓解其疼痛水平即可改善自主活动的抑制。青藤碱具有一定镇静作用[8]，本实验观察到青藤碱在3～30 mg/kg 虽无明显镇静作用，但呈现出降低自主活动的趋势。本课题组[12]也发现青藤碱在高剂量(80 mg/kg)时出现镇静作用。所以推测当青藤碱加大剂量时，其对自主活动微弱的抑制作用会抵消其因缓解疼痛而对自主活动抑制的改善作用，故青藤碱在10～30 mg/kg 时改善作用反而下降。而对于筑巢行为实验，0.18%～0.32%的乳酸均会引起明显筑巢行为抑制，说明在较低疼痛水平就会抑制筑巢活动，所以较大剂量(20～30 mg/kg)青藤碱明显缓解疼痛，才能改善筑巢行为。但加大青藤碱剂量会对运动功能有微弱抑制作用，所以青藤碱30 mg/kg 对筑巢改善作用反而低于20 mg/kg。同时，筑巢行为实验受环境因素影响较大，不同批次的动物实验可能因不同时间、温度、噪音及光暗环境下结果略有差异。所以每次观察药物疗效时，都要以同一批次实验的动物造模作为阴性对照。本研究还发现阳性对照药酮洛芬对乳酸诱发的疼痛激发行为以及抑制行为均有改善作用，与文献[16]结果一致；将其作用和青藤碱进行比较，结果发现青藤碱在减轻疼痛激发行为以及改善自主活动抑制方面要弱于酮洛芬，但对疼痛引起的筑巢抑制的恢复作用要优于酮洛芬。

综上所述，本研究成功建立乳酸诱发的疼痛抑制行为的测试方法，通过从疼痛抑制行为角度研究青藤碱的镇痛作用，发现青藤碱在显著抑制疼痛的激发行为同时，还能有效改善疼痛的抑制行为，这更加确证了青藤碱的镇痛作用，为青藤碱作为镇痛药物应用于临床提供了可靠的依据。