抗菌多糖水凝胶负载细胞治疗皮肤创伤的实验研究*

汤晓璇，顾心逸，陈晓莉，凌 珏*，杨宇民*

(南通大学 教育部/江苏省神经再生重点实验室/神经再生协同创新中心，南通 226001)

众多研究[1-6]已证明水凝胶是在三维(3D)环境中用于细胞培养的合适且生物相容的材料。细胞负载有望将活细胞或工程化的组织构建体有效地转运至目标部位，然后发挥治疗作用，修复受损的组织或器官。

组织损伤是最常见的临床问题，其伤口的闭合也至关重要。目前，外科手术后60%的伤口通过缝合或缝合钉闭合[7]。但在机械移除不可降解的缝线或缝合钉时，由于软组织的脆弱性和局部应力可导致继发性损伤，因此有必要开发医用粘合剂，无缝合伤口闭合以简化手术程序，缩短恢复时间，并提高患者的护理质量[8]。

在水凝胶内进行细胞封装和3D 细胞培养具有明显的优势。首先，与预制的多孔支架相比，通过各种启动策略对细胞悬浮的前体溶液进行相容且快速的固化(几秒钟到几分钟)，细胞能够在水凝胶中均匀地分布[9-11]。此外，凝胶前体溶液可以填充到任何形状的组织缺损中，匹配各类伤口，以确保与宿主组织的空间适应性[12]。最后，从纳米凝胶颗粒到宏观体系的构建，水凝胶可以满足生物医学应用的实际要求[13-14]。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞 南通大学实验动物中心提供的成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量为180～250 g，雄性。L929 小鼠成纤维细胞系从中国科学院细胞库购取。大肠埃希菌菌种、金黄色葡萄球菌菌种从中国微生物菌种保藏中心购取。

1.2 主要试剂及仪器 海藻酸钠(sodium alginate,SA)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉(上海阿拉丁生化科技有限公司)；壳聚糖(南通兴成生物有限公司)；丙烯酰胺(上海麦克林生化科技有限公司)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐[1-(3-Dimethy laminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC](TCI)；2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES)缓冲液、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(N,N′-methylenebisacrylamide,MBAA)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine,TEMED)、过硫酸铵(ammonium persulphate,APS)、硫酸钙(CaSO4)(Sigma-Aldrich)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)(HyClone)；DMEM 高糖基础培养基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco)；氯化钠(NaCl)、葡萄糖、蔗糖(西陇化工股份有限公司)；活死细胞染色试剂盒(Molecular Probes)；戊巴比妥钠(Sigma)；0.9%氯化钠溶液(山东齐都药业有限公司)；多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)；伊红-苏木精染色液(上海碧云天生物技术有限公司)；中性树脂(上海索桥生物技术有限公司)。电热恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；分析电子天平(日本SHIMADZU 公司)；超纯水仪(Millipore)；冰冻切片机(Leica CM3050S)；共聚焦激光扫描显微镜(德国莱卡)；ZEISS-AX10 正置研究级光学显微镜(ZEISS)。

1.3 水凝胶制备

1.3.1 SA 水凝胶的制备 用MES 缓冲液(pH=5)配制2%(w/v)SA 溶液，搅拌过夜至澄清。取10 mL SA溶液，加入191 μL 离子交联剂0.75 mol/L 的CaSO4混匀，静置成胶。

1.3.2 海藻酸钠/壳聚糖/聚丙烯酰胺(sodium alginate/chitosan/polyacrylamide,SCM)复合水凝胶的制备 用MES 缓冲液(pH=5)配制2%(w/v)SA、2%(w/v)壳聚糖混合溶液，搅拌过夜至澄清，再加入4%(w/v)丙烯酰胺，搅拌混匀。取10 mL SA、壳聚糖、丙烯酰胺混合溶液，加入缩合剂NHS、EDC 各120 mg，充分搅拌混匀。再依次加入12 μL 共价交联剂2%MBAA，3 μL 促凝剂TEMED，75 μL 引发剂0.27 mol/L 的APS，191 μL 离子交联剂0.75 mol/L 的CaSO4混匀，静置成胶。

1.4 细胞3D 培养 将L929 细胞以1×106/mL 的密度包裹在水凝胶中，培养1、2、3 d 后进行活死细胞染色。将细胞培养液弃去，按1∶1 比例加入基础培养基和活死细胞染料工作液，室温孵育30～45 min，然后使用共聚焦激光扫描显微镜观察活/死细胞，绿色为钙黄绿素标记的活细胞，红色为乙锭标记的死细胞。活死细胞染料工作液配制：10 mL PBS+5 μL Component A +20 μL Component B。

1.5 水凝胶的抗菌测定 在48 孔板中成胶，将孔板中的水凝胶浸泡并用灭菌的ddH2O 泡洗24 h，每4 h 更新一次无菌水以除去细菌。将10 μL 细菌悬浮液(106CFU/mL)铺展于水凝胶表面，并将接种后的水凝胶在37 ℃生化培养箱孵育4 h。孵育后，用1 mL无菌PBS 加到每个孔中以重悬所有存活的细菌，将10 μL 细菌悬浮液(106CFU/mL)溶于1 mL PBS 中作为阴性对照。取100 μL 稀释菌液涂布平板，在37 ℃下孵育约16 h 后测定菌落数。每组重复测试3 次，结果表示为细菌杀死率，细菌杀死率/%=(对照组细菌菌落数-水凝胶上存活的细菌菌落数)/对照组细菌菌落数×100。

1.6 体内降解 根据南通大学实验动物伦理委员会批准的标准指南处理所有动物。参考国家标准(GB/T1688)，采用成年雌性新西兰白兔(2.5～3.0 kg)，通过兔子背部皮下植入评估水凝胶的体内降解特性。切开兔子背部皮肤(长约1 cm)，制造一个外侧皮下口袋，将水凝胶样品(10 mm×3 mm×3 mm)在无菌条件下植入。手术后，允许兔子在单个笼子中自由移动，并按标准喂养食物和水。在指定的时间(第1、2、3个月)处死新西兰白兔，手术切除周围组织，对样品进行体内降解研究。水凝胶体内降解率/%=(W0-Wt)/W0×100。W0：水凝胶植入前冻干质量；Wt：水凝胶植入一定时间取出后的冻干质量。

1.7 构建伤口修复模型 动物实验由南通大学实验动物中心审查并批准。复合麻醉剂腹腔注射麻醉27 只健康的雄性SD 大鼠(180～250 g)，并背部剃毛，在每只大鼠的背部创建1 个圆形的全层伤口(约2 cm×2 cm)，然后将它们随机分为A、B、C 组。A 组，用生理盐水处理作为阴性对照；B 组，使用商业伤口敷料(主要成分SA 水凝胶)作为阳性对照；C 组，用SCM 水凝胶处理伤口(先将预凝胶溶液引入缺损处以适合伤口，再室温原位成胶)；D 组，用负载L929细胞的SCM 水凝胶处理伤口。水凝胶和生理盐水的前体溶液通过使用200 nm 注射器式过滤器过滤而灭菌。手术后，将大鼠单独关在笼子里，使其愈合，检查伤口，并在第0、1、4、7 天拍照记录并取材。

1.8 苏木精和伊红(H&E)染色 在第1、4、7 天，使用4%的多聚甲醛溶液灌注大鼠，收集伤口部位的样品。将组织梯度脱水，制备冰冻切片；将切片转移到装有ddH2O 的染料罐中，泡洗3～5 min；苏木精溶液染色20 min，用水洗涤；0.5%盐酸分色3～10 s，自来水流水冲洗＞30 min，直到观察到蓝色；分别用50%、70%和80%乙醇处理样品5 min，伊红(由95%乙醇溶液稀释)染色1 min；95%乙醇洗涤2 次、无水乙醇洗涤2 次，5 min/次；乙醇/二甲苯洗涤、二甲苯溶液洗涤3 次，5 min/次，完全脱水；中性树胶封片，在通风橱中干燥；最后，使用正置显微镜观察H&E 染色结果。

1.9 统计学方法 所有数据使用Graphpad Prism 5.0 软件分析。结果以表示，两组间比较采用两尾未配对的T 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 水凝胶制备 成功制备了SA 水凝胶和SCM复合水凝胶，见图1。Ca2+与海藻酸的侧链共价键合；MBAA、TEMED 和APS 促进丙烯酰胺交联；而EDC和NHS 促进了壳聚糖和海藻酸盐之间酰胺键的形成。固化后的两种水凝胶，具有良好的形态稳定性，可以制备成特定形态。

图1 水凝胶实物图

2.2 细胞3D 培养 细胞在水凝胶中3D 培养1、2、3 d，进行活死细胞染色(绿色荧光代表活细胞；红色荧光代表死细胞)，共聚焦显微镜拍照观察，见图2。细胞能够在两种水凝胶中均能存活良好，3 d 时，只观察到少量死细胞(红色)。细胞存活率均>75%，两组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图2 L929 细胞封装于水凝胶1、2、3 d 后进行活死细胞染色

图3 L929 细胞封装在两种水凝胶中1、2、3 d 后的细胞存活率比较

2.3 抑菌特性 稀释涂布平板结果显示，与对照组相比，SCM 水凝胶对大肠埃希菌(革兰阴性细菌)和金黄色葡萄球菌(革兰阳性细菌)均具有良好的表面抗菌特性，而SA 水凝胶无明显抑菌作用，见图4。定量统计结果显示，SA 水凝胶对两种菌的抑菌率均<25%。SCM 水凝胶组对两种菌的抑菌率均>75%，SCM 水凝胶抑菌效果明显优于SA 水凝胶(P<0.001)，见图5。

图4 水凝胶培养大肠埃希菌/金黄色葡萄球菌稀释涂布平板图

图5 水凝胶培养大肠埃希菌/金黄色葡萄球菌抑菌率统计图

2.4 体内降解 将SCM 水凝胶植入兔子背部皮下一定时间后观察、取材，评价该水凝胶的体内降解特性。SCM 水凝胶体积随植入时间的增加而显著减少，并且植入部位周围没有显著不良反应，质量统计数据表明，水凝胶的降解率随植入时间的延长而增加，在植入3 个月后SCM 水凝胶可降解约50%，见图6。

图6 水凝胶体内降解情况

2.5 伤口修复 使用生理盐水(A 组)、商用敷料主要成分SA 水凝胶(B 组)、SCM 水凝胶组(C 组)和负载L929 细胞的SCM 水凝胶(D 组)修复大鼠背部伤口，观察第0、1、4、7 天的伤口恢复情况，结果显示C 组与D 组的背部创面愈合效果整体优于A 组和B 组，见图7。伤口大小恢复度定量统计结果显示，与A 组和B 组对照相比，在第1 天和第4 天，C 组与D 组伤口恢复有明显改善(P<0.01)；同时，在第4 天，D 组伤口恢复明显优于C 组(P<0.05)，而随着时间的推移，在第7 天时所有组间差异均无统计学意义(P>0.05)，见图8。H&E 染色结果显示，与B 组和C 组相比，D组中水凝胶与伤口周围组织形成了紧密而无缝的界面，促进了细胞从伤口周围组织更快地迁移到水凝胶中，在第7 天时细胞完全浸润于水凝胶中，见图9。

图7 0、1、4、7 d 采集的大鼠背部伤口照片

图9 SD 大鼠皮肤伤口中原位形成水凝胶的组织切片的H&E 染色图像

3 讨 论

皮肤创伤是最常见的组织损伤之一[15]。伤口的闭合及随后的愈合会影响患者的身心状况，因此提高伤口愈合的效率对患者自身和社会经济都具有重大意义[16]。而促进伤口修复的关键在于如何简化伤口的愈合过程，加快伤口的闭合，以及防止伤口感染。因此，对理想伤口敷料的需求不断增加[17]。

当前伤口敷料的主要目的是粘合伤口，保持伤口部位的水分，促进组织修复[18]。因此，本研究构建了具有良好组织相容性的水凝胶敷料，聚丙烯酰胺与海藻酸链形成的互穿交联网络使水凝胶具有更好的力学性能与形态稳定性，有利于水凝胶适应在体伤口修复的动态过程。同时，添加氨基桥连聚合物-壳聚糖，利用氨基羧基缩合反应形成共价键，可原位成胶以匹配各种形态的伤口，实现与受损组织边缘的紧密粘合。

同时，伤口敷料应具有良好的抑菌特性，避免伤口感染[19]。抑菌实验[20-21]显示，SCM 水凝胶对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有显著的抗菌活性，因为壳聚糖带电的氨基能够破坏细菌细胞壁，导致细胞内液释放。另一方面，水凝胶对大肠埃希菌的抑制效果均比金黄色葡萄球菌低，这是因为与金黄色葡萄球菌相比，大肠埃希菌的细胞壁结构更为复杂[22]。实验表明，壳聚糖赋予了水凝胶出色的抗菌特性，有利于水凝胶的体内应用。

生物材料中细胞的存活和生长对于组织修复和再生至关重要[23]。而体内几乎所有细胞都位于细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中，细胞和ECM 一起形成复杂的三维(3D)架构。由于2D 表面和ECM之间存在环境差异，2D 细胞培养通常无法反映体内细胞的生理行为，在3D 培养的许多细胞类型显示出与2D 细胞培养中的细胞行为不同的特定细胞行为(如黏附、迁移、形态发生、基因表达等)[24]。此外，研究[25]发现，成纤维细胞可在损伤后生成皮肤胶原纤维，是促进受损皮肤早期修复的关键。实验证明了L929 成纤维细胞在3D 水凝胶支架中生长良好，可用于细胞负载，并具有成为3D 培养基的潜力。同时，新西兰白兔背部皮下植入实验显示该水凝胶有着良好的体内降解性，将适合于体内应用。

在全厚度皮肤缺损模型中进一步评估了水凝胶负载成纤维细胞促进伤口愈合的效果，结果显示负载细胞的水凝胶在早期1、4 d 内显示出明显的创面修复和皮肤再生优势，这归因于壳聚糖固有的抗菌性能和止血性能[26-28]，以及水凝胶敷料提供的潮湿伤口环境[29]。同时，成纤维细胞是间充质来源的细胞，它们负责结缔组织中大多数ECM 的产生，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损的修复有着十分重要的作用[30]。

综上所述，负载细胞的抗菌多糖水凝胶可以有效地促进伤口修复，但水凝胶中成纤维细胞对皮肤再生促进作用的具体机制有待进一步研究明确。