硫化氢通过下调NLRP3/caspase-1信号通路抑制氧化型低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞焦亡*

何婷婷， 张旭琳▲， 贾珍丽， 王 昀， 马克涛，2， 李 玲， 张 亮，2△

（1石河子大学医学院基础医学系，新疆石河子 832000；2国家卫生健康委中亚高发病防治重点实验室，新疆石河子 832000；3石河子大学医学院医学教学实验中心，新疆石河子 832000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为一种炎症性血管疾病，其发病过程中伴随的血管内皮炎症是导致血管内皮损伤，并诱发AS 发生发展的首要环节［1-2］。近年研究表明血管内皮细胞的炎性死亡——细胞焦亡在AS发生发展过程中发挥着关键作用［3-7］。

细胞焦亡是一种由炎症应答引起的新型程序性细胞死亡［5-9］，其发生的关键分子途径为核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）/caspase-1 介导的细胞焦亡信号通路［10］。已有研究表明，高脂饮食及其他AS 致病危险因素可引起血管内皮细胞中NLRP3 的激活［3-6，10-15］，NLRP3 可与含caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）结合，进而募集并激活细胞焦亡发生关键蛋白caspase-1［5，9］，使其形成由p10 和p20 亚单位构成的四聚体［7，9］；激活的caspase-1 可裂解活化下游的gasdermin D（GSDMD）及焦亡相关炎症介质，如白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 前体，裂解激活的GSDMD 蛋白N 端结构域（GSDMD-N）可在细胞膜表面组装形成穿膜孔道，最终引发血管内皮细胞焦亡［5-6］；与此同时，活化的IL-1β和IL-18还可通过GSDMD-N穿膜孔道释放而加重血管炎症反应，并最终导致动脉结构功能受损及AS的发生发展［4，6，9］。已有研究表明，药物阻断或基因敲除上述细胞焦亡信号通路中的关键蛋白可有效抑制血管内皮细胞焦亡及AS 的发生发展［4，6，11-12，14，16］。因此，以细胞焦亡及其信号通路作为重要干预靶点可为治疗AS提供新的思路。

内源性硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）作为一种具有“多面手”角色的重要气体信号分子，研究者对其在心血管疾病中的治疗保护作用均已达成共识。虽然H2S对AS的防治作用及机制研究已积累了不少实验证据，但目前关于H2S 对AS 发生发展过程中血管内皮细胞焦亡的调控作用及其机制尚不清楚。因此，本研究采用AS 致病关键因素——氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，oxLDL）刺激人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），构建血管内皮细胞焦亡模型，旨在探讨缓释型H2S 供体GYY4137 对oxLDL 诱导的血管内皮细胞焦亡的抑制作用及其调控机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞 HUVECs 购自American Type Culture Collection（ATCC）。

1.2 药物和试剂 内皮细胞专用培养液和胎牛血清购自Sciencell；oxLDL 购自广州奕源生物科技有限公司；H2S 供体GYY4137 购自Sigma-Aldrich；CCK-8细胞活力检测试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司；Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；细胞蛋白抽提试剂盒和脱脂奶粉均购自北京索莱宝科技有限公司；NLRP3 兔多克隆抗体、procaspase-1 兔单克隆抗体、caspase-1（p20 亚单位）兔多克隆抗体、GSDMD 兔单克隆抗体和GSDMD-N 兔单克隆抗体购自Abcam；IL-18 兔单克隆抗体购自武汉三鹰公司；GAPDH 鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的II抗（HRP山羊抗兔或HRP山羊抗小鼠）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Western blot 化学发光底物试剂盒购自Millipore。

1.3 主要仪器 CO2培养箱和自动酶标仪（Thermo Fisher Scientific）；高速低温冷冻离心机（Eppendorf）；倒置荧光显微镜（SANYO）；电泳仪和转膜仪（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 将冻存复苏的HUVECs以2×106L-1接种于25 cm2细胞培养瓶中，使用内皮细胞专用培养液（含5%胎牛血清、1%双抗和1%内皮生长因子）在细胞培养箱（37 ℃、5% CO2及饱和湿度）中培养，根据细胞生长速度，每隔2～3 d更换细胞培养液并传代，取2～4代处于对数生长期的HUVECs进行内皮细胞鉴定（内皮细胞特异性标记CD31 阳性率≥95%）及后续研究，根据不同实验目的，调整接种时的细胞密度为（1～5）×109L-1。

2.2 药物干预与分组

2.2.1 药物干预浓度筛选 药物干预之前将处于对数生长期（汇合率为80%～90%）的HUVECs 接种于含5%胎牛血清培养液的96 孔培养板（接种密度为每孔8×103细胞）中贴壁4 h，之后更换为无血清培养液饥饿培养12 h，最后使用不同药物对其进行处理。根据文献报道［3，17-18］，采用不同浓度的oxLDL（0、25、50 和100 mg/L）和GYY4137（50、100 和200 μmol/L），以及指定药物组合［GYY4137（100 和200 μmol/L）预处理4 h，再加入终浓度为100 mg/L 的oxLDL 继续培养24 h］，于含1%血清的完全培养液中处理HUVECs 24 h，采用CCK-8 法（参见2.3）检测不同浓度的oxLDL 和GYY4137 对HUVECs 活力的影响，从中筛选出oxLDL 与GYY4137 的最佳干预浓度；并通过LDH 释放（参见2.4）、Hoechst 33342/PI染色（参见2.5）和Western blot（参见2.7）检测不同浓度oxLDL对HUVECs 细胞焦亡及其信号通路标志蛋白表达的影响。

2.2.2 实验分组 药物干预之前将处于对数生长期（汇合率为80%～90%）的HUVECs 接种于含血清培养液的6孔培养板（接种密度为每孔1×106细胞）中贴壁4 h，之后更换为无血清培养液饥饿培养12 h，最后使用不同药物对其进行处理，并分为以下4 组：（1）空白对照（control）组：以含1%血清的完全培养液培养HUVECs 24 h；（2）GYY4137 干预组：200 μmol/L GYY4137 处理HUVECs 24 h；（3）oxLDL 处理组：终浓度25、50 和100 mg/L 的oxLDL 处理HUVECs 24 h；（4）oxLDL+GYY4137 干预组：200 μmol/L GYY4137 预处理HUVECs 4 h，再加入终浓度为100 mg/L的oxLDL处理细胞24 h。

2.3 细胞活力检测 待HUVECs 汇合度为80%～90%时，用0.05%胰蛋白酶消化收集HUVECs，并将细胞接种于96 孔板，用含血清培养液于细胞培养箱中培养4 h，待细胞贴壁后更换为无血清培养液饥饿培养12 h。之后加入上述不同药物干预24 h。干预后弃去原培养液并用PBS 漂洗，之后向每孔加入含10%CCK-8 试剂的培养液100 μL，另设空白孔（不含细胞，只含10%CCK-8的培养液）。在细胞培养箱中孵育2 h后，使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（absorbance，A）。实验每组设置6 个复孔，重复5次。细胞相对活力（%）=（样品平均A值-空白孔平均A值）/（空白对照组平均A值-空白孔平均A值）×100%。

2.4 LDH 释放率检测 各组细胞接种于96 孔板中，经不同药物干预处理24 h后，首先将各组细胞培养液上清（25 μL）收集于96孔板中，之后向无血清培养液对照及含有25 μL 培养液上清的96 孔板中加入25 μL 反应底物，并于37 ℃条件下孵育15 min，之后再向上述反应样品中加入25 μL 2，4-二硝基苯肼，并于37 ℃条件下孵育15 min 进行显色反应，最后向反应样品中加入250 μL 反应终止液于室温下孵育5 min 终止反应，最后于490 nm 波长处测定A值，根据公式LDH 释放率（%）=（处理样品吸光度-对照样品吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度-对照样品吸光度）×100%，计算出各组细胞培养液上清中的LDH 含量。以上实验重复4次。

2.5 Hoechst 33342/PI 染色 上述各组细胞经不同药物干预处理24 h 后，向含有细胞的6 孔板中加入10 μL Hoechst 33342（5 mg/L）染液于37 ℃条件下避光孵育10 min，之后再向细胞中加入5 μL PI（2 mg/L）染液于37 ℃条件下避光孵育15 min，PBS 溶液漂洗2 次后使用倒置荧光显微镜观察拍照，随机选取3个不同视野，计算每个视野中的细胞总数及红色荧光细胞数，参照文献［19］，计算PI＋细胞比例（%）=红色荧光细胞数/细胞总数×100%。以上实验重复3次。

2.6 H2S含量测定 各组细胞经不同指定浓度药物干预处理24 h 后，胰酶消化收集各组细胞并向其中加入500 μL预冷的磷酸缓冲液（50 mmol/L，pH 6.8）裂解匀浆，并测定各组细胞裂解液中的总蛋白浓度；向含有430 μL 细胞裂解液的离心管中加入含有2 mmol/L 磷酸吡哆醛和10 mmol/L L-半胱氨酸的磷酸缓冲液（pH 7.4），封口膜密封离心管后将其置于37 ℃水浴锅中孵育30 min；然后使用注射器通过离心管管盖向上述密封离心管中注入250 μL 1%醋酸锌，混匀后继续将上述反应混合物置于37 ℃水浴锅中孵育90 min；随后向离心管中依次加入250 μL 三氯乙酸（0.1 g/mL）、133 μLN，N-二甲基对苯二胺（20 mmol/L）和133 μL三氯化铁（30 mmol/L），充分混匀后于4 ℃、12 000×g条件下离心10 min；随后吸取200 μL 各组上清及标准品反应液（NaHS，0～250 μmol/L）加入96 孔酶标板中，使用酶标仪于670 nm波长测定各待测样品及标准品的A值。最后根据蛋白浓度计算各组细胞中的H2S 含量（单位：nmol/106cells）。以上实验重复3次。

2.7 Western blot 实验 将对数生长期的HUVECs接种于6孔板（每孔1×106细胞）后使用不同药物对其进行处理24 h。收集各组细胞，按照试剂盒操作说明提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，置于-80 ℃保存备用。取50 μg 蛋白等量上样，在8%或12%SDSPAGE 中恒压分离。之后采用湿转法将总蛋白转移至PVDF 膜上，并将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉溶液中于室温下封闭1～2 h；在室温下用1×TBST 缓冲液漂洗封闭后的PVDF 膜，并将其放入含有抗NLRP3、抗pro-caspase-1、抗caspase-1、抗GSDMD、抗GSDMDN、抗IL-18 和抗GAPDH 抗体（1∶1 000）溶液中，于4 ℃条件下孵育过夜；用TBST 缓冲液将膜上的多余Ⅰ抗漂洗干净后，将其放入Ⅱ抗溶液（1∶10 000）中室温孵育1～2 h。洗膜，显色，曝光压片，观察结果并进行分析。以上实验重复3次。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 6 软件进行统计分析和柱状图绘制。所有实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间数据比较采用单因素方差分析（oneway ANOVA）及LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 GYY4137 抑制oxLDL 诱导的HUVECs 活力降低

为筛选并优化所使用药物的最佳浓度，我们首先评估了oxLDL 或（和）H2S 缓释型供体GYY4137 对HUVECs 活力的影响。实验结果如图1所示，与空白对照组相比，低浓度（25 mg/L）的oxLDL及中、高浓度（50 和100 μmol/L）的GYY4137 对HUVECs 活力无显著影响（P＞0.05），50 mg/L 和100 mg/L oxLDL 可使HUVECs 活力显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），见图1A；而200 μmol/L GYY4137 则可使HUVECs 活力显著增加（P＜0.05），见图1B；此外，与oxLDL 处理组相比，200 μmol/L 的GYY4137 还可使oxLDL 处理的HUVECs活力显著升高（P＜0.05），见图1C。

Figure 1. The effect of different concentrations of oxLDL or/and GYY4137 on the viability of HUVECs. A：the HUVECs were treated with different concentrations of oxLDL for 24 h；B：the HUVECs were treated with different concentrations of GYY4137 for 24 h；C：the HUVECs were pretreated with GYY4137（100 and 200 μmol/L）for 4 h，and then incubated with oxLDL（100 mg/L）for 24 h. Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.图1 不同浓度oxLDL和GYY4137对人脐静脉内皮细胞活力的影响

2 oxLDL诱导的HUVECs细胞焦亡模型的建立

为进一步证实oxLDL 对血管内皮细胞焦亡的促进作用，本研究检测了不同浓度oxLDL 对HUVECs焦亡及焦亡标志蛋白表达的影响。结果显示，与空白对照组相比，低浓度（25 mg/L）oxLDL 对HUVECs中PI+染色比例和LDH 释放率均无显著影响（P＞0.05），而50 mg/L和100 mg/L的oxLDL可使HUVECs的PI+染色比例及LDH 释放率显著升高（P＜0.05 或P＜0.01），见图2；此外，与空白对照组相比，50 mg/L和100 mg/L 的oxLDL 可显著上调HUVECs 中细胞焦亡标志蛋白NLRP3、caspase-1（具有活性的p20 亚单位）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18 蛋白水平（P＜0.05或P＜0.01），但oxLDL 对pro-caspase-1 的表达较空白对照组则无显著影响（P＞0.05），见图3。

Figure 2. The effect of different concentrations of oxLDL on pro-inflammatory programmed death of HUVECs. A：representative double staining of Hoechst 33342（blue）and PI（red）in HUVECs（scale bar=100 μm）and the percentage of the PI positive cells to total cells；B：LDH release rate in the media. Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.图2 不同浓度的oxLDL对人脐静脉内皮细胞焦亡的影响

Figure 3. The effect of different concentrations of oxLDL on the expression of pyroptosis-related proteins in HUVECs. The protein levels of NLRP3，pro-caspase-1，caspase-1，GSDMD，GSDMD-N and IL-18 in HUVECs were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.图3 不同浓度oxLDL对人脐静脉内皮细胞焦亡相关蛋白表达的影响

3 GYY4137 抑制oxLDL 诱导的HUVECs 焦亡及焦亡标志蛋白的表达

我们选取100 mg/L 的oxLDL 和200 μmol/L 的GYY4137 单独或联合干预HUVECs，并检测了各组细胞中的H2S 水平、LDH 释放率、PI+染色细胞比例及焦亡标志蛋白的表达。结果显示，与空白对照组相比，oxLDL 可显著抑制HUVECs 中H2S 的合成（P＜0.05），并上调细胞LDH 释放率（P＜0.05）、PI+染色的细胞比例（P＜0.05），以及焦亡信号通路关键蛋白NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18的表达（P＜0.05）；而与oxLDL 组相比，GYY4137 和oxLDL 联合干预则可显著提高HUVECs 中的H2S 含量（P＜0.05），并使PI+染色细胞比例和LDH 释放率显著下降（P＜0.05），且GYY4137 还可显著抑制oxLDL诱导的细胞焦亡关键蛋白NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 及IL-18 的表达上调（P＜0.05），见图4～6。

Figure 4. The effect of GYY4137 on the concentration of H2S in oxLDL-treated HUVECs. Mean±SD.n=4.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.图4 GYY4137 对oxLDL 处理的人脐静脉内皮细胞中硫化氢含量的影响

Figure 5. The effect of GYY4137 on oxLDL-induced pro-in fl ammatory programmed death of HUVECs. A：representative double staining of Hoechst 33342（blue）and PI（red）in HUVECs（scale bar=100 μm）and the percentage of the PI positive cells to total cells；B：LDH activity in the media. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.图5 GYY4137对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞焦亡的影响

Figure 6. The effect of GYY4137 on the expressions of pyroptosis-related proteins in oxLDL incubated HUVECs. The protein levels of NLRP3，pro-caspase-1，caspase-1，GSDMD，GSDMD-N and IL-18 in HUVECs were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs oxLDL group.图6 GYY4137对oxLDL处理的人脐静脉内皮细胞中焦亡相关蛋白表达的影响

讨论

血管内皮炎症反应及其诱导的血管内皮细胞死亡是AS 发生发展的始动环节［1，20］，而oxLDL 作为导致血管内皮结构功能损伤和AS 发生发展的重要直接致病因素，其可使血管内皮细胞产生炎症反应［4-6，9］，并会导致血管内皮细胞活力降低及死亡［21］。本研究中采用不同浓度的oxLDL处理HUVECs，同样观察到中、高浓度的oxLDL 可使HUVECs 的活力显著降低，此结果与相关研究报道相一致［3，22-23］。因此，抑制oxLDL 诱导的血管内皮炎症及其损伤是AS防治的重要治疗策略。研究表明oxLDL 引起的血管炎症可导致血管内皮细胞发生细胞焦亡［3］，其发生的最终结果为膜穿孔的形成以及细胞的渗透性裂解［5-6，9］。而本研究采用鉴定细胞焦亡发生的常用检测方法——Hoechst33342/PI 染色和LDH 释放率测定［1，5，19］初步证实了oxLDL 可显著诱导HUVECs 的焦亡。

细胞焦亡发生的关键分子机制是NLRP3炎症小体和caspase-1 的激活［4］，激活的caspase-1（p10/p20四聚体）可裂解GSDMD 蛋白，使其N 端结构域形成膜穿孔，最终导致细胞焦亡并向胞外释放出由caspase-1 裂解激活的IL-1β 和IL-18 等炎症介质而引起更为严重的炎症应答［4-6］。目前体内和体外实验研究已充分表明高脂饮食和其他AS 发病危险因素如ox-LDL［3，6］、胆固醇结晶［5，13］、高同型半胱氨酸［9，15］和尼古丁［24］均可上调并激活NLRP3、caspase-1、IL-18 和GSDMD 而引发血管内皮细胞的焦亡及AS 的发生发展；而药物阻断或基因敲除NLRP3或caspase-1则可抑制AS 致病危险因素诱导的血管内皮细胞焦亡及AS 动物模型主动脉中AS 斑块的发生发展［4，6，11-12，14，16］。在本研究中，我们也观察到中、高浓度的oxLDL 可通过上调HUVECs 中NLRP3、caspase-1（p20）、GSDMD、GSDMD-N 和促炎细胞因子IL-18的表达而激活细胞焦亡信号通路。因此，本研究结果进一步表明NLRP3 炎症小体/caspase-1 信号通路的激活直接参与了oxLDL 诱导的血管内皮细胞焦亡，并且oxLDL 诱导的血管内皮细胞焦亡对于探讨AS发生发展的关键机制、寻求AS防治策略具有重要意义。

H2S作为一种重要的内源性气体信号分子，可通过调节不同生物学过程发挥心血管保护、抗炎、抗AS 及抗高血压作用［25］，然而，H2S 是否可调控NLRP3炎症小体/caspase-1 介导的细胞焦亡尚不完全清楚。在本研究中，我们采用H2S 供体GYY4137 深入研究了其对oxLDL 诱导的血管内皮细胞焦亡和焦亡标志蛋白表达的影响。结果显示oxLDL 可抑制HUVECs中H2S 的合成，并激活细胞焦亡信号通路、上调细胞焦亡相关标志蛋白的表达，从而诱导HUVECs 发生焦亡。而GYY4137 干预则可通过提高细胞内H2S 水平而使血管内皮细胞活力显著升高，并对oxLDL 诱导的细胞焦亡具有显著抑制作用。通过Western blot进一步表明GYY4137可通过下调HUVECs中细胞焦亡信号通路标志蛋白（NLRP3、caspase-1、GSDMD、GSDMD-N和IL-18）的表达而抑制oxLDL诱导的细胞焦亡信号通路的激活及细胞焦亡。虽然已有研究表明H2S 或其供体药物可通过抑制细胞焦亡信号通路标志蛋白（NLRP3、ASC 和caspase-1）的表达而发挥治疗急性肾损伤、抗炎、抗AS 及抗高血压作用［26-29］，但以上研究的目的主要针对H2S 对NLRP3 激活的调控作用，且因缺乏细胞焦亡相关指标（LDH 释放率、Hoechst 33342/PI 染色和细胞焦亡执行者GSDMD 蛋白的表达）检测而未能充分阐明H2S对细胞焦亡的调控作用。而本研究结果不仅显示出H2S 对oxLDL 诱导的NLRP3 激活的抑制作用，且还通过细胞焦亡相关指标及GSDMD 蛋白的表达检测进一步阐明了H2S对细胞焦亡的抑制作用及其调控机制。

综上所述，H2S供体GYY4137可通过下调NLRP3炎症小体/caspase-1细胞焦亡信号通路而抑制oxLDL诱导的血管内皮细胞焦亡。