17种中药多糖提取物的理化性质研究*

李承浩，郑富香，游广娇，任晓亮，邓雁如

（天津中医药大学中药学院，天津 301617）

多糖又称多聚糖，是由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的高聚物，分子量为数万至数百万，用通式（C6H10O5）n表示[1-3]。多糖不仅在生物体生命活动中起着重要的营养作用，而且还在维持生物体的生命活动中发挥着重要生理功能，因此其与脂质、蛋白质、核酸一起被视为生物体中最重要的4种大分子物质[4-6]。

多糖是一种很好的佐剂，不仅可以作为一种能量物质和结构成分，还有一部分多糖可以参与细胞的代谢及生理调节。近年来，关于活性多糖生物功能的报道主要包括多糖的抗肿瘤、抗凝血、抗氧化、降血脂、抗病毒、提高免疫功能等，如牛膝多糖为水溶性的小分子多糖，具有调节免疫、保护肝脏、抑制肿瘤作用；如桑黄多糖具有抗肿瘤、调节免疫、治疗肝炎、抗炎、抗氧化、降血糖等生理活性。除了作为药物用于治疗，中药多糖在皮肤领域也具有延缓衰老、美白、晒后修复、祛痘抗炎、促进创伤愈合等功效，可以作为功效化妆品活性成分的天然来源，还可以作为凝固剂、润滑剂、增稠剂、絮凝剂、悬浮剂、凝胶剂、添加剂等广泛应用于化工、食品、石油、纺织印染、水处理和医药等行业。

中药多糖主要来源于植物、藻类和微生物类。其中植物类多糖种类最为繁多，且没有细胞毒性，应用于生物体毒副作用小，所以在医药和保健品行业得到了更好的推广及应用[7-8]。本文选用17种市面常售多糖研究其多糖含量与蛋白质含量、吸湿性、黏度、抗氧化活性，希望总结出多糖的共性，为以后的多糖应用提供依据[9-10]。

1 材料

1.1 药品与试剂 黄芪多糖，批号：SJH17102201，购自西安四季生物科技有限公司；虫草多糖，批号：CC20170625，购自兰州百禾生物科技有限公司；大枣多糖，购自西安通泽生物科技有限公司；枸杞多糖，批号：20170725，购自西安通泽生物科技有限公司；白桦茸多糖，批号：TZ170810，购自西安通泽生物科技有限公司；灰树花多糖，批号：2017091204，购自西安万方生物科技有限公司；白术多糖，批号：BZ20170715，购自兰州百禾生物科技有限公司；刺五加多糖，批号：GN170606-SG，购自宁波金艾农生物科技有限公司；土茯苓多糖，购自陕西森弗天然制品有限公司；甘草多糖，批号：GCDT170714，购自陕西森弗天然制品有限公司；黄精多糖，购自西安美川生物科技有限公司；桑黄多糖，购自西安万方生物科技有限公司；党参多糖，购自西安维珍生物科技有限公司；猪苓多糖，批号：Virgin170301，购自西安维珍生物科技有限公司；海带多糖，批号：CY170901，购自陕西慈源生物技术有限公司；蒲公英多糖，批号：CY170807，购自陕西慈源生物技术有限公司；牛膝多糖，批号：QZ17-7-26，购自西安青芷生物技术有限公司；苯酚，分析纯，购自西陇科学股份有限公司；浓硫酸，分析纯，购自开封开化有限公司试剂厂；无水葡萄糖，批号：160824，纯度≥98%，购自上海融禾医药科技发展有限公司；蒸馏水，购自屈臣氏食品饮料有限公司；考马斯亮蓝G-250试剂，购自北京索莱宝科技有限公司；维生素C，批号：171204，纯度≥98%，购自上海融禾医药科技发展有限公司；FeCl3·6H2O，分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司；FeSO4·7H2O，分析纯，购自天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备 旋转黏度计（NDJ-79，上海平轩科学仪器有限公司）；台式高速离心机（TG16-WS，长沙湘仪离心机仪器有限公司）；十万分之一天平（Sartorius BT125D，赛多利斯科学仪器有限公司）；pH计（PB-10，赛多利斯科学仪器有限公司）；万分之一天平（FA2004A，上海精天电子仪器有限公司）；电热鼓风干燥（WC-20，天津市中药机械厂）；温湿计时表（WS-A6，上海天宇科技仪表有限公司）；智能磁力加热搅拌器（SZCL-4B，巩义市予华仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司）；数显恒温水浴锅（HH-S8，金坛盛蓝仪器制造有限公司）。

2 方法

2.1 中药多糖的含量测定

2.1.1 标准曲线建立 精密称定105℃干燥至恒质量的无水葡萄糖标准品2.00 mg于10 mL棕色容量瓶内，加蒸馏水稀释至刻度，得到0.2 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别精密量取葡萄糖标准品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.2、1.5 mL 于 10 mL 具塞试管中，补水至2.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液后迅速加入浓硫酸5 mL，摇匀，室温放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出冰水浴5 min，冷却至室温，于490 nm波长处测定吸光度，以空白试剂为参照测定吸光度。

以对照品浓度X（mg/mL）为横坐标，吸光度Y（ΔAbs）为纵坐标绘制标准曲线。得到标准曲线回归方程为 Y=12.421X+0.206 1（r=0.999 5），表明葡萄糖标准品在0.005～0.15 mg/mL线性关系良好。

2.1.2 精密度实验 精密称取葡萄糖对照品溶液，连续测定6次，RSD为0.47%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性实验 精密称取白术多糖粉末0.2 g定容至100 mL容量瓶，从中精密量取2 mL于具塞试管中，平行6份，然后加入5%苯酚1 mL、浓硫酸5 mL，静置 5 min，水浴 15 min，冰浴 5 min，放置室温后测定其吸光度。RSD为2.20%，表明重复性良好。

2.1.4 稳定性实验 取“2.1.3”项下配制好的溶液，每隔10 min测定1次吸光度，RSD为0.98%，表明样品在1 h内稳定性良好。

2.1.5 加样回收率实验 精密吸取白术多糖样品溶液6份，每份2 mL，分别精密加入一定量的葡萄糖标准品，按上述方法操作测定吸光度，计算得到加样回收率为98.06%，RSD为2.39%，符合方法学要求。

2.1.6 多糖含量测定 分别精密称定多糖粉末2 g于100 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀至溶解完全，4 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm），取上清，即得多糖溶液。精密量取适量多糖溶液，加蒸馏水稀释得到0.02 mg/mL的供试品溶液。精密吸取供试品溶液2.0 mL，按照“2.1.1”项下自“加入1 mL 5%苯酚溶液”起依法操作，平行6份。根据回归方程及公式计算市售多糖样品的多糖含量。样品中多糖含量（%）＝cdvm×1 000。其中，c为样品待测液中葡萄糖的质量浓度（mg/mL），d为待测液的稀释倍数，v为待测液的总体积（mL），m为称取的样品质量（g）。根据回归方程及公式计算得到17种市售多糖含量均较高[11-14]。

2.2 蛋白质含量测定

2.2.1 标准曲线的建立 考马斯亮蓝试剂配置：称取100 mg考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%的乙醇及加入100 mL 85%的磷酸，加蒸馏水稀释至1 L，最终溶液含0.01%的考马斯亮G-250、4.7%的乙醇及8.5%的磷酸，置于棕色试剂瓶中备用，4℃保存。蛋白标准液配置：精密称取牛血清白蛋白10mg置于10 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度即得1.0 mg/mL的牛血清蛋白标准溶液，4℃储存（用后放入冰箱）。分别精密量取1.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液 0.01、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL于10 mL具塞试管中，加水补足至1 mL，得到梯度浓度对照品溶液，向试管中加入考马斯亮蓝试剂5.0 mL混匀，室温放置10 min，用紫外可见分光光度计测定其于595 nm下的吸光度，以蒸馏水为空白对照，以牛血清白蛋白溶液X（mg/mL）为横坐标，吸光度Y（△Abs）为纵坐标绘制标准曲线。得到标准曲线回归方程为 Y=4.597X+0.093（r=0.999 0），线性范围为0.01～0.3 mg/mL。

2.2.2 精密度实验 精密量取浓度为0.06 mg/mL的标准牛血清白蛋白溶液1 mL，加入考马斯亮蓝G-250显色剂5.0 mL混匀，室温放置10 min后于595 nm测定吸光度，连续测定6次。RSD为0.40%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性实验 精密称取500 mg灰树花多糖样品，稀释50倍得到浓度为10 mg/mL的样品溶液，从中量取1 mL，平行6份，按上述方法操作测定吸光度。RSD为2.22%，表明稳定性良好。

2.2.4 稳定性实验 精密量取10 mg/mL的灰树花多糖样品溶液1 mL，按上述方法操作，每隔10 min测定吸光度，RSD为2.0%，1 h内其线性范围良好。

2.2.5 加样回收率实验 取10 mg/mL的灰树花多糖样品溶液0.5 mL，加入浓度为0.4 mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液0.5 mL，再加入5 mL考马斯亮蓝G-250显色试剂，混匀，室温放置10 min，于595 nm处测定吸光度，以0号试管为空白对照，根据标准曲线算出相应浓度，计算加入蛋白质量，并计算回收率，分别进行6次平行测定。RSD为2.98%，提示线性范围良好。

2.2.6 蛋白质含量测定 精密称定各多糖样品粉末0.1 g于10 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀至完全溶解，得到浓度为10 mg/mL的多糖溶液。精密量取多糖溶液1 mL，按照本实验“2.2.1”项下自“向试管中加入考马斯亮蓝试剂5.0 mL”起依法操作，平行测定3次，并根据回归方程计算多糖粉末中蛋白质含量[15-18]。

2.3 多糖吸湿性测定 在已恒质量的称量瓶底部分别加入1.5 g干燥多糖粉末，置玻璃干燥容器内备用；将底部含有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器放入25℃烘箱中恒温24 h，此时干燥器内的相对湿度为50%；将多糖粉末置于有氯化钠过饱和溶液的干燥箱中，于25℃恒温箱中保存，定时取样称取质量，重复3次，计算吸湿百分率。经观察，发现所有的多糖粉末随着时间的延长均呈现出不同程度的吸湿效果[19-22]。吸湿百分率=（吸湿后质量-吸湿前质量）/吸湿前质量×100%。

2.4 多糖黏度测定

2.4.1 多糖溶液浓度对黏度的影响 将多糖溶液配置成 0.02、0.05、0.10、0.15 g/mL 不同浓度的多糖溶液，室温下磁力搅拌充分溶解，在剪切速率750 r/min条件下测定其黏度3次，取平均值。

2.4.2 温度对多糖溶液黏度的影响 配置浓度为0.15 g/mL的多糖溶液，在剪切速率为750 r/min条件下，将多糖溶液分别在25、45、65、85℃搅拌，测定其黏度变化[23-24]。

2.5 总抗氧化能力测定

2.5.1 溶液制备 FRAP试剂：1）300 mmol/L，pH=3.6的醋酸钠缓冲溶液：称取无水醋酸钠0.187 1 g，加入冰醋酸1.6 mL，加蒸馏水至100 mL。采用pH计测定其pH为3.6。2）10 mmol/L TPTZ（溶解在40 mmol/L盐酸溶液中）：精确量取浓盐酸（36%～38%）0.333 mL，用水定容至100 mL容量瓶内，得到40 mmol/L盐酸溶液。精确称取TPTZ粉末31.23 mg于10 mL棕色容量瓶内，用40 mmol/L盐酸溶液稀释至刻度，得到10 mmol/L TPTZ溶液澄清透明。3）20 mmol/L FeCl3：精确称取 FeCl3·6H2O 固体粉末54.06 mg于10 mL棕色容量瓶内，加蒸馏水稀释至刻度，得到20 mmol/L FeCl3溶液。将醋酸钠缓冲溶液（300 mmol/L，pH=3.6）、TPTZ（10 mmol/L）和 FeCl3（20 mmol/L）以体积比 10∶1∶1 比例混合，配成 FRAP试剂（临用前新鲜配制）[25]。

对照品溶液：精密称取27.8 mg FeSO4·7H2O颗粒于10 mL棕色容量瓶内，加入蒸馏水稀释至刻度，得到10 mmol/L的FeSO4溶液。精密量取FeSO4溶液适量，加水逐级稀释，分别得到浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L 的对照品溶液。

样品溶液：精密称取多糖粉末25 g于50 mL棕色容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，水浴加热至溶解完全，放至室温，4 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm），取上清得到多糖溶液。分别精密量取适量中药多糖溶液，加蒸馏水稀释，得到5种不同浓度样品溶液。

阳性对照溶液：另精密称定维生素C对照品2 mg于10 mL棕色容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，得到浓度为0.2 mg/mL的维生素C溶液。取维生素C溶液适量，逐级稀释，得到6种不同浓度维生素C溶液。

2.5.2 标准曲线绘制 分别精密量取0.2 mL不同浓度的对照品溶液于10 mL具塞试管内，迅速加入6mL孵育的FRAP试剂，于37℃下水浴放置30min，取出测定相应的吸光度值，检测波长为595 nm。以蒸馏水为空白对照。以FeSO4溶液的浓度（mmol/L）为横坐标X，吸光度为纵坐标Y（△Abs），绘制FeSO4溶液的标准曲线，进行回归分析。所得方程为Y=0.710 8X-0.007 1，相关系数r为0.999 8，线性范围为0.1～5.0 mmol/L。

2.5.3 样品测定 分别精密量取0.2 mL各浓度样品溶液及维生素C溶液于5 mL具塞试管内，按照本实验“2.5.2”项下“迅速加入6 mL孵育的FRAP试剂”依法操作，测定吸光度。FRAP值是以1mmol/L FeSO4为标准，通过FeSO4标准曲线计算，达到相同吸光度值所需FeSO4量，此值即为样品的FRAP值。以各样品溶液、维生素C溶液的FRAP值为纵坐标Y，溶液浓度（mg/mL）为横坐标X，绘制各样品总抗氧化能力图[26-29]。

3 实验结果

3.1 17 种多糖的理化性质分析 市售的17种中药多糖粉末中多糖含量、蛋白质含量如表1所示，其中多糖含量较高，蛋白质含量较少，其中党参多糖中多糖含量最高，枸杞多糖中多糖含量最低。

表1 17种多糖含量、蛋白质含量数据%

多糖的吸湿性测定结果如图1所示，结果表明17种多糖均具有较好的吸湿性，其中刺五加多糖的吸湿性最低，枸杞多糖的吸湿性最高。如图2所示，多糖黏度随溶液浓度升高而增强，可能是由于多糖浓度升高，多糖链之间的相互作用加强，导致多糖分子结构发生变化，从而使多糖溶液黏度变大。考察温度对多糖溶液黏度的影响，结果如图3所示，多糖黏度随温度的升高而降低，这是由于温度升高导致多糖分解，生成了小分子的糖，使自身黏度下降[30-32]。

图1 多糖吸湿曲线图

图2 多糖黏度与浓度关系图

图3 多糖黏度与温度关系图

3.2 抗氧化能力测定结果 应用铁离子（Fe3+）还原法测定多糖的体外抗氧化活性，当Y值为1时所测得的X值为多糖对Fe3+还原能力浓度，可知每种多糖均具有抗氧化能力。其中刺五加多糖的抗氧化能力最强，黄精多糖抗氧化能力最弱。将17种多糖与维生素C对Fe3+还原能力的对比可知，17种中药多糖对Fe3+均具有还原能力，但其抗氧化活性低于维生素C。见表2。

表2 17种中药多糖与维生素C的总抗氧化能力

4 讨论与结论

以往对中药有效成分的研究通常集中在小分子物质，多见生物碱、萜类、黄酮、挥发油及苷类等小分子化合物，而蛋白质、多糖、多肽等生物大分子物质相对较少。而实际上，生物大分子也是中药重要的有效成分，由于受到研究技术和方法的限制，且生物大分子本身的分离、纯化和结构测定难度较大，导致鲜有研究。

本实验首先采用苯酚-硫酸法测定17种中药多糖粉末中多糖含量，通过黏度计、紫外可见分光光度法等方法研究各多糖的黏度、吸湿性、蛋白含量等基本理化性质。研究结果表明，市售的17种中药多糖粉末中多糖含量均较高，且蛋白质含量非常低。多糖的吸湿性测定结果表明，多糖具有较好的吸湿性。多糖黏度测定结果表明，多糖黏度随溶液浓度升高而增大，可能是因为增大多糖浓度，使多糖链之间的相互作用加强，导致多糖分子结构发生变化，从而使多糖溶液黏度变大。多糖黏度随温度升高而降低，这是由于温度升高，导致多糖分解，生成了小分子的糖，使多糖结构发生了变化，从而黏度下降。应用铁离子还原法测定多糖的体外抗氧化活性，将17种多糖与维生素C对Fe3+还原能力的比较可知，17种中药多糖对Fe3+的还原能力较弱，其中刺五加多糖在17种多糖中抗氧化能力最强，但也仅为维生素C的1/43。本文总结了17种多糖的理化性质，希望可以对日后多糖的研究提供理论性支持。