轻型缺血性卒中后认知障碍与脑动态功能连接状态改变的功能磁共振成像研究

肖瑞珠，左丽君，周怡君，陈姚静，刘艳亭，刘涛

卒中后认知功能障碍的患者比例高达59%[1-2]，尽早对卒中患者的认知功能障碍进行预测和评价，是卒中后认知功能障碍干预的关键[3]。静息态功能磁共振成像（resting statefunctional magnetic resonance imaging，rsfMRI）可通过计算不同脑区间血氧水平依赖信号（blood oxygen level dependent，BOLD）的相关性，构建特定的功能连接（functional connectivity，FC）网络来研究大脑的功能异常[4-8]。FC网络的相关研究多假设FC在静息扫描过程中是保持恒定的，但实际上FC也会随着时间波动[9]，而基于rs-fMRI的动态功能网络连接（dynamic functional network connectivity，dFNC）是一种可用于研究大脑短期内FC动态变化的新方法[10-11]。近年来，已有研究通过dFNC方法在一些精神类疾病中观察到FC状态的明显变化[12-15]，但卒中后认知功能与大脑动态FC状态之间的关系尚不清楚。本研究以卒中后有认知障碍（cognitive impairment，CI）患者与卒中后无认知障碍（no cognitive impairment，NCI）患者为研究对象，利用dFNC方法探索CI、NCI的缺血性卒中患者与健康人之间动态FC状态的差异，并在基线与3个月随访期探索CI与NCI患者动态FC状态的变化。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2014年12月1日-2016年5月31日，首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心连续招募年龄在35～65岁的首次轻型急性缺血性卒中（NIHSS≤3分）患者进行前瞻性研究。受试者均接受标准基线评估，包括完整的人口社会学调查、血管危险因素评估、神经心理学评估和多模态MRI检查。

纳入标准：①年龄35～65岁；②患者的病变位于前循环皮质下（基底节、丘脑、放射冠、脑室周围白质或内囊）；③NIHSS≤3分；④发病时间为7 d内的急性卒中；⑤无既往卒中或TIA病史；⑥急性缺血性卒中根据世界卫生组织标准进行诊断[16]，并经头颅CT或MRI证实；⑦患者有一位知情者，在患者被招募前至少5年内每周均与患者见面。

排除标准：①有癫痫发作、偏头痛病史；②非皮质下卒中；③文盲（小学以下文化程度）；④存在无法配合神经心理学测试的身体或精神状况；⑤汉密尔顿抑郁量表（Hamilton depression scale，HAMD）评分≥17分[17]；⑥老年人认知功能减退知情者问卷（informant questionnaire on cognitive decline in the elderly，IQCODE）评分＞3.38分[18]；⑦有痴呆病史，或发病前已存在认知功能障碍；⑧头颅MRI扫描头动＞3 mm或3 °。

为与卒中患者的认知功能进行对比，本研究还招募了志愿者作为健康对照（healthy control，HC），所有HC均接受神经心理学评估和头颅MRI检查。纳入标准为年龄、性别与卒中组相匹配，无精神障碍病史，且头颅MRI显示无明显腔隙性梗死。

本研究由首都医科大学附属北京天坛医院伦理审查委员会批准（审查编号：KY2015-001-01），受试者均签署知情同意书。

1.2 神经心理学评估及分组 所有急性缺血性卒中患者在发病后10 d（基线）和3个月（随访期）由神经内科医师进行神经心理学评估。NIHSS评估卒中的严重程度、HAMD评估抑郁程度、基础性日常生活活动（basic activities of daily living，BADL）量表和工具性日常生活活动（instrumental activities of daily living，IADL）量表分别评估基本日常功能和复杂日常功能。此外，所有患者还接受全认知域神经心理学测试，包括：①总体认知，采用MoCA进行评估；②记忆功能，采用听觉词语学习测验（auditory verbal learning test，AVLT）进行评估；③视觉延迟记忆，采用Rey-Osterrieth复杂图形测验（Rey-Osterrieth complex figure test，ROCFT）进行评估；④视觉运动速度，采用符号数字模式测验（symbol digit modality test，SDMT）进行评估；⑤语言功能，采用波士顿命名测验（Boston naming test，BNT）、动物流畅性测验（animal fluency test，AFT）进行评估；⑥注意和执行功能，采用数字连线测验A/B（trail making test-A/B，TMT-A/B）进行评估。

根据MoCA评分将患者分成CI组（MoCA≤22分）和NCI组（MoCA≥23分）[1]。

1.3 影像学数据采集 受试者在首次卒中10 d内（基线）和3个月后（随访期）均采用西门子3.0T Prisma MRI扫描仪进行数据采集。使用单次激发平面回波成像（single shot echo planar imaging，single-shot EPI）获取rs-fMRI图像，主要扫描参数为：重复时间（repetition time，TR）2500 ms，回波时间（echo time，TE）30 ms，翻转角度90 °，体素大小2.86 mm×2.86 mm×3 mm，图像矩阵70×70×43。另外，采集高分辨T1WI图像，主要参数为：TR 2300 ms，TE 2.3 ms，翻转角度8 °，体素大小0.94 mm×0.94 mm×1 mm，图像矩阵256×256×192。

1.4 数据处理与分析

1.4.1 数据预处理 基于MATLAB 2018a，使用DPABI工具包（http：//rfmri.org/DPABI）对头颅MRI数据进行预处理，主要步骤：①去除前10个时间点，保留稳定的信号；②时间层矫正与头动矫正；③使用EPI模板将所有图像配准到蒙特利尔神经病学研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）标准脑空间；④对图像进行平滑，平滑参数为全宽半高（full-width of half-maximum，FWHM）值=8 mm；⑤去线性漂移；⑥对脑脊液和脑白质信号进行回归；⑦滤波去噪，带宽为0.01～0.1 Hz。

1.4.2 独立成分分析与脑网络划分 通过独立成分分析（independent component analysis，ICA）方法划分脑区。基于MATLAB 2018a，使用GIFT（https：//trendscenter.org/software/gift/）工具箱中的infomax算法进行组水平ICA，并设定独立成分（independent component，IC）为100。使用icasso算法确保所估计IC的稳定性，然后根据既往文献[19]的IC挑选方法选出24个有意义的IC，并通过Allen等[10]的IC分区模板划分成7个脑网络：执行控制网络（executive control network，EC）、听觉网络（auditory network，AUD）、视觉网络（visual network，VIS）、默认网络（default-mode network，DMN）、感觉运动网络（sensorimotor network，SM）、小脑（cerebellum，CB）和皮层下网络（subcortical network，SC）（图1）。

图1 各网络独立成分的空间位置示意图

1.4.3 dFNC与动态FC状态划分 设定时间窗=20TR、步长=1TR，对各IC进行滑窗操作，计算每个窗口中所有BOLD信号两两之间的Pearson相关系数，构建一系列动态FC矩阵，各组样本均执行以上操作。然后结合各组所有样本的动态FC矩阵进行聚类，划分为多个具有代表性的动态FC状态（图2）。根据以上步骤，动态功能网络最终聚类成4个代表性FC网络状态：①模块化连接状态，表现为AUD、SM、VIS之间具有明显模块化特征的强连接；②强连接状态，表现为整个大脑每个网络内及网络间均存在较强的正连接；③局部连接状态，表现为各网络之间存在局部性连接；④稀疏连接状态，表现为每个网络内和网络间都仅存在少量弱连接（图3）。

图2 动态功能连接网络构建过程示意图

图3 动态功能连接网络状态

1.4.4 动态特征的计算 根据划分的动态FC状态，在各组中分别计算以下动态特征：①时间比例（fraction time），表示每个状态占总时间的百分比；②驻留时间（dwell time），表示每个状态的平均持续停留时间；③转换次数（transition），表示每个状态之间相互转换的总次数。

1.5 统计学方法 采用SPSS 26.0软件包进行一般临床资料和dFNC动态特征的统计分析。连续变量进行正态性检验，符合正态分布的用表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的用M（P25～P75）表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。分类变量以频数（%）表示，两组间或多组间比较采用χ2检验。同组两个时间点之间的比较采用配对样本t检验（正态分布）或Wilcoxon符号秩检验（非正态分布）。以P＜0.05为差异有统计学意义。多重比较均对P值进行Bonferroni校正（其中分类变量三组间的事后两两比较，P值调整为0.05/3=0.017，即P＜0.017为差异有统计学意义）。

2 结果

2.1 基线资料与两个时间点认知功能比较 本研究共纳入CI组15例，NCI组11例，HC组29例。对于人口社会学信息，与NCI组相比，CI组的受教育年限更少；与HC组和NCI组相比，CI组的IADL评分更高，差异有统计学意义（均P＜0.05）。对于血管危险因素，与HC组相比，CI组与NCI组吸烟、饮酒、高血压、脂代谢紊乱者比例更高，CI组的糖尿病患者比例更高，差异有统计学意义（均P＜0.017）。在认知方面，与HC组比较，CI组MoCA、AVLT、ROCFT、SDMT、BNT、AFT评分均更低，TMT-A/B的反应时长更长，而NCI组只有AVLT和SDMT评分更低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与NCI组比较，CI组MoCA、ROCFT、AFT评分均更低，TMT-A的反应时长更长，差异有统计学意义（表1）。

表1 三组人口社会学、血管危险因素、认知功能比较

在基线和随访期两个时间点之间，CI组随访期只有ROCFT评分较基线明显升高（P=0.023），其他认知功能项目评分或反应时长比较差异均无统计学意义（表2）。

表2 卒中后有认知障碍组患者基线与随访期认知功能比较

2.2 dFNC动态特征比较 HC组、CI组和NCI组在基线和随访期各连接状态的时间比例差异均无统计学意义。在基线，HC组、CI组和NCI组仅在稀疏连接状态的驻留时间差异有统计学意义（P=0.035），经过Bonferroni校正后，两两间的驻留时间差异均无统计学意义；在随访期，各连接状态的驻留时间差异均无统计学意义。纵向比较中，与基线相比，CI组随访期在模块化连接状态的时间比例明显下降（P=0.035），在稀疏连接状态的时间比例明显上升（P=0.025），在模块化连接状态的驻留时间明显减少（P=0.012）；NCI组随访期各连接状态的时间比例和驻留时间差异均无统计学意义。对于转换次数，所有组间的差异均无统计学意义（表3）。

表3 各功能连接状态动态特征比较

3 讨论

本研究通过基于rs-fMRI构建dFNC的方法为CI与NCI患者的大脑功能变化提供了一种新的测量手段，以动态的角度更深入地了解卒中后认知功能恢复过程中潜在的脑网络连接机制，为卒中后认知功能障碍相关的研究提供新的认识。

本研究发现，虽然HC组、CI组和NCI组在基线和随访期各连接状态的时间比例差异均未达统计学意义，但与HC组相比，CI组基线和NCI组基线在局部连接状态的时间比例存在上升趋势、在稀疏连接状态的时间比例存在下降趋势，而CI组随访期和NCI组随访期在这两个状态中则存在向HC组恢复的趋势。局部连接状态的特点是各脑区之间都有可能出现小部分的强连接。在基线，即卒中急性期，这种局部脑区FC增加的现象可能是一种功能代偿[20]，这种机制可让大脑更灵活地调用其他脑区来对部分缺失的大脑功能进行替补，从而加强卒中患者大脑功能的调控。这种代偿机制并不少见，如在卒中患者运动功能的相关研究中，有研究表明在卒中两周内初级运动皮层、听觉皮层和视觉皮层与其他脑区间的连接会更为频繁[21]；一项专门针对急性卒中患者运动执行网络的研究发现，初级运动皮层与其他脑区FC的动态变化明显增多[22]。这些研究均发现卒中梗死区附近通常会和其他远处的脑区构成新的FC[23]，以补偿部分受损脑区的缺失功能。同时随着大脑功能的恢复，FC将逐渐恢复正常[24]。本研究的结果进一步支持了这种代偿现象的解释，说明卒中患者无论有无认知障碍，急性期时只要大脑出现了组织损伤，可能都会出现一定程度的功能代偿以保持大脑基本功能的稳定；同时在随访期，大脑功能逐渐恢复，这种功能代偿逐渐减弱，因此其大脑FC状态也逐渐往正常状态恢复。

从基线到随访期，只有CI组在模块化连接状态的时间比例与驻留时间明显降低，同时在稀疏连接状态的时间比例明显增加。这可能说明模块化连接状态的变化与认知功能的变化存在一定联系。模块化连接状态最明显的特征为AUD、SM和VIS网络之间的FC增强，CI患者基线模块化连接状态的增多可能同样是一种代偿，但与前面局部连接状态的增多不同，这更可能是一种认知功能的代偿。从所有认知量表的评价结果可知CI患者基线的总体认知、视觉、语言等功能都有明显的缺陷，可能是基底节损伤破坏了皮层下组织与额叶脑区等认知相关脑区的信息交流而导致的[25]，为了弥补部分认知功能的严重缺陷，AUD、SM和VIS脑区的FC增加，以维持部分语言、感觉、视觉等功能。在有运动障碍的卒中患者中，代偿机制是运动功能动态恢复的标志[24]，因此推测，在CI患者中，这种代偿机制的出现可能同样意味着认知功能有逐渐恢复的趋势。近年来，已有研究表明有语言障碍的卒中患者存在大脑半球内FC增加以恢复语言功能的代偿现象[26]，也有研究通过动态因果模型分析方法发现CI患者的神经元模型中出现了额外的连接路径[27]，还有研究通过基于种子点的FC发现CI患者梗死周围相关脑区的FC显著增加，提示损伤和代偿共存[28]。另外，还有研究提示认知功能网络的FC在认知功能受损的初期会先增加，然后逐渐减少，最终随着认知功能的恢复达到正常水平[24]。本研究结果显示CI患者模块化连接状态的变化趋势与此相一致，说明CI患者在随访期时，认知功能可能已逐渐出现好转，但从主观的量表评分中却没有太多明显的变化，仅能观察到视觉延迟记忆功能的改善，意味着在主观量表评分出现明显变化之前，大脑的动态FC状态已出现了显著改变，因此dFNC或许能够为卒中患者认知功能的恢复效果提供一种新的客观评价手段。

本研究的优点是采用了新的dFNC方法来探索卒中后认知功能障碍与动态FC状态之间的关系，并且进行了纵向研究。局限性是本研究的样本量较少，个体差异较大，因此在进行组间比较时可能因为方差较大导致有些趋势显然存在但却并不显著。但在小样本的研究中，在P＞0.05的统计水平并不意味着差异一定不存在统计学意义，相反地，如果直接忽略这些结果很可能会错过重要信息，因此小样本的均值趋势结果同样应引起关注[29]。

本研究通过dFNC方法发现CI和NCI患者的动态FC状态均发生改变，这些改变可能意味着受损大脑的一种代偿和恢复的过程。尤其在卒中患者认知功能的评价上，动态FC状态的改变可能比主观的量表评分能够更早地发现认知功能的恢复，从而为卒中患者认知功能的预测与评价提供更为客观的影像学依据。

【点睛】动态功能网络能更早、更客观地反映卒中患者认知功能的改变，未来将可能成为一种卒中患者认知功能的新的临床辅助诊断工具。