头孢菌素C产生菌的诱变育种及发酵应用

牛李杰，张 婷，党建宁，张宝新

(伊犁川宁生物技术股份有限公司，新疆 伊宁 835000)

头孢菌素C(Cephalosporin C)，全称7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰胺基)头孢霉烷酸，是一种亲水性的β-内酰胺类抗生素，主要作为7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的合成中间体[1]。头孢菌素C通过抑制细菌细胞壁肽的合成起到抑菌作用，具有抑菌范围广、对人体毒性较小等优点[2-3]。

头孢菌素C的产生菌为顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium)，生长较慢，在发酵过程中容易出现抗性丢失、菌种退化的现象，因此需要不断进行自然和诱变选育来保证菌种的优良性能，防止菌种衰退[4]。为了选育出性能优良的菌株，常采用紫外诱变、微波诱变、化学诱变等方法，但是微生物突变生理生化反应复杂，通过单一诱变往往难以达到目标。因此，诱变育种多采用复合诱变法，即组合两种或者两种以上化学或其它诱变剂使菌株发生较大的突变，进而筛选出优良菌株来提高效价[5]。曹栋等[6]通过紫外诱变结合终产物抗性的方法筛选到的突变菌株RM-8的头孢菌素C效价比出发菌株提高了45%。任璐[7]通过紫外诱变筛选到铜离子、丙二酸、头孢菌素C-钠盐耐受的突变菌株，并验证了耐受突变菌株与高产突变菌株有一定的联系，从耐受突变菌株中更容易得到高产突变菌株。孟国庆等[8]通过物理化学复合诱变的方法筛选到的高产菌株经摇瓶发酵后，头孢菌素C效价达到2.83 g·L-1，比出发菌株提高了154.6%。黎亮等[9]对顶头孢霉进行了紫外-氯化锂复合诱变处理，并对培养基进行了优化，在160 t发酵罐中培养高产菌株，其效价比出发菌株提高了22.6%以上。

作者采用紫外线和丙二酸复合诱变的方法筛选头孢菌素C高产菌株，并对筛选出的高产菌株进行50 L发酵罐小试验证，为后期中试及工业化生产提供优良菌种和数据支持，对丰富菌种资源和提高生产效率具有现实意义。

1 实验

1.1 菌种与培养基

顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium)B-1822-S-04，保存于伊犁川宁生物技术股份有限公司。

PDA培养基(g·L-1)：马铃薯浸粉5.0，葡萄糖20.0，硫酸铵15.0，琼脂15.0，自然pH值。

种子摇瓶培养基(g·L-1)：黄豆粉28.0，酵母浸膏28.0，玉米浆19.0，蔗糖30.0，葡萄糖10.0，碳酸钙5.0，pH值7.00±0.05。

发酵摇瓶培养基(g·L-1)：花生粉28.0，酵母浸膏30.0，黄豆粉35.0，玉米浆15.0，玉米粉20.0，硫酸铵1.0，碳酸钙15.0，消泡剂1.4，pH值7.20±0.05。

15 L一级种子罐培养基(g·L-1)：黄豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖25.0，碳酸钙5.0，玉米浆50.0，葡萄糖10.0，消泡剂0.35，pH值7.8，121 ℃灭菌35 min。

50 L二级种子罐培养基(g·L-1)：黄豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖8.0，豆油10.0，碳酸钙6.5，硫酸铵2.5，硫酸镁2.0，葡萄糖24.5，淀粉20.0，玉米浆60.0，消泡剂0.35，pH值6.0，121 ℃灭菌35 min。

50 L发酵罐培养基(g·L-1)：花生粉17.0，谷朊粉14.0，玉米粉11.0，糊精20.0，蛋氨酸15.0，硫酸铵8.0，豆油53.0，玉米浆100.0，硫酸钙9.0，碳酸钙5.0，消泡剂0.25，pH值6.8，121 ℃灭菌35 min。

1.2 仪器

30W/5A型紫外灯，上海四通特种灯泡厂；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HWS-250型恒温恒湿培养箱，上海比朗仪器制造有限公司；ZWY-2102型恒温振荡培养箱，上海沪粤明科学仪器有限公司；SB-C18型高效液相色谱仪，安捷伦；CX31型显微镜，奥林巴斯；WS-500YDA型灭菌锅，济南宁乐医疗器械有限公司；PHS-3C型pH计，上海盛磁仪器有限公司；PL3002型电子天平，瑞士梅特勒-托利多；PHCBI型超低温冰箱，日本三洋；50 L型六联发酵罐，上海百仑生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

刮取活化培养的菌株B-1822-S-04孢子，与0.9%无菌生理盐水混合，置于旋涡振荡器上振荡20 s使孢子混合均匀，用双层无菌脱脂棉纱布过滤，得菌悬液，适当稀释控制孢子浓度约为106个·mL-1。

1.3.2 致死率和正突变率的测定

统计诱变处理平板上的菌落数，以未经诱变处理平板上的菌落数作为对照，按下式计算致死率：

1.3.3 效价的测定[10-11]

按1.3.1方法制备菌悬液，经种子和发酵摇瓶培养后，将发酵液于3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，用0.44 μm过滤器过滤，采用HPLC法测定效价(头孢菌素C含量，下同)。

HPLC检测条件：安捷伦SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),流速1.0 mL·min-1，进样量10 μL，柱温30 ℃，检测波长254 nm，流动相：0.01 mol·L-1乙酸钠∶乙腈=98∶2(体积比)，pH值4.0。

1.3.4 紫外诱变

吸取5 mL菌悬液置于无菌玻璃平皿中，置于紫外灯下照射，间距15 cm；每隔一定时间(10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s)吸取菌悬液，稀释后涂布于PDA培养基平板上，以未经紫外灯照射的菌悬液作为对照，用黑纸包裹后置于30 ℃培养箱中培养7 d，统计平板上的菌落数，计算致死率，确定最佳紫外诱变时间。

在最佳紫外诱变时间下，再次进行紫外诱变培养，挑取形态、大小、色泽优良的单菌落，经种子和发酵摇瓶培养后测定效价。

1.3.5 紫外线和丙二酸复合诱变

将菌悬液紫外诱变一定时间(最佳诱变时间)，稀释后涂布于含有不同浓度(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%)丙二酸的PDA培养基平板上，然后置于30 ℃培养箱中培养7 d，统计平板上的菌落数，计算致死率，确定最佳丙二酸浓度。

在最佳紫外诱变时间、最佳丙二酸浓度下，再次进行紫外线和丙二酸复合诱变培养，挑取形态、大小、色泽优良的单菌落，经种子和摇瓶发酵培养后测定效价，筛选头孢菌素C高产菌株。

1.3.6 高产菌株筛选及遗传稳定性实验

在确定的最佳复合诱变条件下，对菌悬液进行多次复合诱变处理，进一步筛选高产菌株。将最终选育出的高产菌株进行斜面传代培养，经种子和发酵摇瓶培养后测定效价，验证高产性能的遗传稳定性。

1.3.7 验证实验

在最佳复合诱变条件下，对筛选到的高产菌株进行50 L发酵罐小试。首先将摇瓶种子液接入15 L一级种子罐，再将一级种子液接入50 L二级种子罐，然后将二级种子液接入50 L发酵罐中，每12 h取样测定效价。整个过程严格按照工艺参数进行调控。

2 结果与讨论

2.1 紫外诱变结果

菌悬液经过不同时间的紫外诱变，稀释后涂布于培养基平板上，培养7 d后计算致死率，考察紫外诱变时间对致死率的影响，结果见表1。

表1 紫外诱变时间对致死率的影响

由表1可知，随着紫外诱变时间的延长，致死率逐渐升高；0～90 s内致死率升高明显，90 s后致死率升幅趋缓；紫外诱变90 s时的致死率为87.07%，紫外诱变120 s时的致死率达到96.55%。根据前期实验，致死率在80%左右时正突变率较高，因此选择紫外诱变时间为90 s。

2.2 紫外诱变效价检测结果

菌悬液经过90 s紫外诱变后，通过培养筛选出形态、大小、色泽优良的菌株共83株，经种子和摇瓶发酵培养后，测定发酵液效价，结果见表2。

由表2可知，经紫外诱变后的效价基本呈正态分布，效价在3 000～3 999 mg·L-1的菌株最多，有25株；其次是效价在4 000～4 999 mg·L-1，有18株；效价高于出发菌株B-1822-S-04(效价为4 520 mg·L-1)的有16株，占总数的19.28%，其中效价最高达到6 251 mg·L-1，较出发菌株提高了38.29%。

表2 紫外诱变后的头孢菌素C效价

2.3 紫外线和丙二酸复合诱变结果

菌悬液经过90 s紫外诱变，稀释后涂布于含有不同浓度丙二酸的培养基平板上，培养7 d后计算致死率，考察丙二酸浓度对致死率的影响，结果见表3。

表3 丙二酸浓度对致死率的影响

由表3可知，随着丙二酸浓度的增加，致死率逐渐升高；当丙二酸浓度增至1.2%时，致死率为100.00%。因此，1.0%是菌株对丙二酸的耐受临界浓度。

2.4 复合诱变效价检测结果

菌悬液经过90 s紫外诱变，稀释后涂布于含有1.0%丙二酸的培养基平板上，通过培养筛选出形态、大小、色泽优良的菌株共76株，经种子和发酵摇瓶培养后，测定发酵液效价，结果见表4。

由表4可知，经过复合诱变后，效价在4 000～4 999 mg·L-1的菌株最多，有19株；效价高于出发菌株的有22株，占总数的28.95%，其中效价最高达到6 871 mg·L-1，较出发菌株B-1822-S-04提高了52.01%。

表4 复合诱变后的头孢菌素C效价分析

2.5 高产菌株的筛选及其遗传稳定性

在紫外诱变时间为90 s、丙二酸浓度为1.0%的条件下，对菌株B-1822-S-04进行多次紫外和丙二酸复合诱变，筛选到10株头孢菌素C高产菌株，经种子和发酵摇瓶培养后测定效价，结果见表5。

表5 高产菌株的效价

由表5可知，10株头孢菌素C高产菌株中效价较高的是菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其效价分别为6 674 mg·L-1、6 554 mg·L-1、6 816 mg·L-1和6 789 mg·L-1，分别较出发菌株B-1822-S-04提高了47.65%、45.00%、50.80%和50.20%。

对4株高产菌株进行遗传稳定性实验，结果(表6)显示，传代5代后，4株高产菌株的效价虽有下降，但与出发菌株相差不大，说明这4株高产菌株的遗传稳定性较好。将筛选的4株高产菌株分别保存，供后续实验使用。

表6 4株高产菌株的遗传稳定性分析

2.6 高产菌株的小试发酵结果

将筛选到的4株高产菌株分别在50 L发酵罐中培养160 h，效价均呈上升趋势，其中菌株D-G-096的效价最高达到了29 270 mg·L-1(图1)，较摇瓶发酵的效价(6 816 mg·L-1)提高了约4倍，较出发菌株50 L发酵罐的效价(13 868 mg·L-1)提高了111.06%；菌株D-G-133、D-G-017、D-G-083的效价也分别提高了102.57%、94.70%、73.56%。

图1 高产菌株小试发酵过程中的效价变化

2.7 讨论

影响发酵水平的首要因素是菌种资源，性能优良的菌种具有效价高、性能稳定、不易退化变异、对原材料要求低等特点。本实验采用紫外线和丙二酸复合诱变的方法筛选头孢菌素C高产菌株，虽然最终筛选出的菌株D-G-096摇瓶发酵的效价为6 816 mg·L-1，比出发菌株提高了50.80%，但是实验周期较长，过程较为复杂；而传统诱变技术，例如孟国庆[12]、杜淑涛[13]通过原生质体融合技术，Sun等[14]、陈国枝等[15]、胡又佳等[16]通过基因工程技术，李英英等[17]采用ARTP诱变技术，也能筛选出头孢菌素C高产菌株，且简单快速、目的性更强。

本实验将筛选的4株高产菌株进行50 L发酵罐小试，其中菌株D-G-096的效价达到29 270 mg·L-1，是摇瓶发酵的4倍，较出发菌株的50 L发酵罐的效价提高了111.06%。牛永利[18]曾通过实验验证了50 L和5 t发酵罐效价没有太大变化，可以将50 L发酵罐的工艺结论应用到工业化生产中。但是由于菌种不同、培养基配方不同，后期还需要进一步验证500 L、5 t发酵罐的中试发酵情况，将发酵工艺更好地应用于工业化生产。

3 结论

以头孢菌素C产生菌顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium) B-1822-S-04为出发菌株，经过紫外线和丙二酸复合诱变，筛选得到了4株头孢菌素C高产菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其中菌株D-G-096头孢菌素C效价高达6 816 mg·L-1，较出发菌株提高了50.80%，且高产特性稳定；50 L发酵罐小试结果显示，菌株D-G-096的效价达到了29 270 mg·L-1，较出发菌株提高了111.06%，可作为优良高产菌株保存使用。