芽孢杆菌B16对厚垣普可尼亚菌ZK7产孢能力的影响

李雨鑫，孔垂旭，邹顺惺，刘亚君

(云南大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650032)

根结线虫(Meloidogynespp.)是一类专性内寄生于植物根系的生物[1]，其繁殖能力强，寄主广泛，适应力强，是危害农作物的主要病原微生物之一。根结线虫的防治方法主要有化学防治、物理防治、农业防治、生物防治、抗病育种等[2-3]，其中，生物防治具有安全、环境兼容性好等特点，是绿色农业发展的重要保障[4-7]。

厚垣普可尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)是一种寄生真菌，属于半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(丛梗孢目)(Moniliales)、丝孢科(丛梗孢科)(Monilaceae)、普可尼亚属(Pochonia)[8]，菌丝可侵入到根结线虫卵或者死去雌虫留下的包囊中进行无性繁殖，产生分生孢子梗，从而导致根结线虫死亡。厚垣普可尼亚菌可以产生一系列的酶类物质[9]，其中丝氨酸蛋白酶VCP1是降解根结线虫卵卵黄层的主要酶[10]，使几丁质层暴露[11]；胞外几丁质酶能够分解根结线虫卵卵壳的几丁质成分，从而导致根结线虫死亡[12-13]。厚垣普可尼亚菌对根结线虫具有很好的防治效果，是目前研究和开发生防菌剂的主要生防菌之一[14-16]。芽孢杆菌(Bacillussp.)是一类广泛分布于植物根际的生防细菌，能产生抵抗逆境的芽孢，可在土壤中很好地定殖和繁殖[17-19]。芽孢杆菌分泌的碱性丝氨酸蛋白酶能够分解根结线虫的体壁，造成根结线虫内容物的泄露，最终杀死根结线虫。此外，芽孢杆菌的稳定性、与其它化学杀线虫剂的相容性均优于其它生防真菌和非芽孢类生防杆菌[20-22]。

由于土壤生态系统的复杂性，特别是土壤的抑菌作用，单一菌剂的施用防治效果往往不稳定。前期研究发现，厚垣普可尼亚菌ZK7(简称ZK7)与芽孢杆菌BacillusnematocidaB16(简称B16)联合使用能显著提高ZK7对根结线虫的防治效果；连续两年的田间试验结果也表明，根部厚垣普可尼亚菌数量提高了10%～40%，防效提升了30%～50%，根结线虫的抑制率提高了40%～60%[23]。在此基础上，作者研究B16对ZK7产孢能力的影响，并初步鉴定相关信号物质，为进一步揭示细菌提高生防真菌防治根结线虫能力的机制奠定基础。

1 实验

1.1 材料

供试菌株：B16、ZK7，均由云南大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室提供。

南方根结线虫卵块，分离自温室盆栽番茄根结。

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，灭菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃灭菌20 min。

PDB培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，灭菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃灭菌20 min。

NB培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，灭菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.2 菌株发酵液的制备

B16发酵液的制备：用接种环接一环B16菌株于装有200 mL NB培养基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1摇床培养36 h；取发酵液测定600 nm处吸光度(OD600)，当OD600值在1.8～2.0之间时，收集发酵液并分装到50 mL灭菌离心管中，于4 ℃、8 500 r·min-1离心15 min；收集上清液，用0.22 μm细菌滤头过滤除菌，4 ℃保存备用。

ZK7发酵液的制备：用接种刀切取1 cm×1 cm的经PDA平板活化后的ZK7菌块于装有250 mL PDB培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1摇床培养72 h，使其孢子数达到106个·mL-1；将ZK7发酵液用6层灭菌的擦镜纸过滤，除去菌丝体，用血球计数板统计孢子数，调整孢子数为104个·mL-1，4 ℃保存备用。

1.3 促产孢实验

将B16发酵液与ZK7发酵液分别按1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20的比例混合，总体积40 mL；于28 ℃、170 r·min-1摇床共培养，每隔24 h用血球计数板统计孢子数。将NB培养基和ZK7发酵液按上述比例混合作为实验对照，40 mL ZK7发酵液不做任何处理作为空白对照(CK)。处理组和对照组均做3个平行，实验重复3次。

1.4 促产孢挥发性物质的检测

(1)样品的制备

B16培养液的制备：将B16菌株接种于装有200 mL NB培养基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1摇床培养36 h,取5 mL培养液于15 mL顶空瓶中，加盖密封。

ZK7培养液的制备：将ZK7菌株接种于装有200 mL PDB培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1摇床培养36 h，取5 mL培养液于15 mL顶空瓶中，加盖密封。

共培养液的制备：将B16发酵液与ZK7发酵液按1∶7混合，于28 ℃、170 r·min-1摇床共培养36 h，取5 mL培养液于15 mL顶空瓶中，加盖密封。

(2)固相微萃取

将SAAB-57318型75 μm CAR/PDMS 固相微萃取仪的萃取头暴露于培养液上方约1.5 cm处；中速(搅拌时萃取头不接触到样品)搅拌，65 ℃加热，吸附萃取1 h；萃取结束后迅速将萃取头缩回并拔出针头，立即插入到气相色谱气化室的进样口中，轻轻向下推出萃取头，利用气化室的高温条件让待测物解析1 min。

分析条件：Agilent 7890GC/5975MSD型气质联用仪，HP-5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，填料为5%苯基-95%甲基聚硅氧烷；载气为氦气(He)，流速1.0 mL·min-1；进样口温度250 ℃；柱温：起始温度50 ℃，保持2 min，以6 ℃·min-1升温至180 ℃，再以8 ℃·min-1升温至240 ℃，保持10 min；分流进样，分流比10∶1；总运行时间40 min；质谱扫描范围35～550 amu；离子源为EI源；电子能量70 eV。

1.5 促产孢挥发性物质的验证

B16与ZK7共培养后产生了新的挥发性物质。选取2种含量较高的挥发性物质丁内酯、甲苯进行纯品验证，以进一步验证这些挥发性物质是否与ZK7产孢量的增加有关。

将10 mL ZK7发酵液加入到装有150 mL PDB培养基的300 mL三角烧瓶中，然后加入丁内酯/甲苯，使其浓度(以10 mL ZK7发酵液计，mg·mL-1)分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，以不加丁内酯/甲苯为空白对照，在28 ℃、170 r·min-1条件下分别摇床培养24 h、48 h、72 h，用血球计数板统计各处理组的孢子数。

2 结果与讨论

2.1 B16对ZK7产孢量的影响(图1)

注：C表示实验对照，CK表示空白对照；对72 h数据进行单因素方差分析以及图基多重比较，*表示P<0.05,**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，下图同。

从图1可以看出，B16发酵液与ZK7发酵液按1∶5、1∶7、1∶10比例混合时，B16对ZK7的产孢有一定促进作用，其中按1∶7比例混合共培养时对ZK7产孢量的影响最显著。与空白对照相比，ZK7的产孢量最高提高了318.31%；在扣除NB培养基的影响后，产孢量最高提高了183.17%。

2.2 促产孢挥发性物质的检测结果(表1)

从表1可以看出，B16单独培养时产生的挥发性物质包括hexanal、2,5-dimethyl-pyrazine、2-heptanone、benzaldehyde、benzeneacetaldehyde、3-eicosene、(E)-benzeneacetaldehyde、2-nonanone、decanal、dodecanal、(Z)-9,17-octadecadienal、fluorene、(Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid、2-hydroxy-cyclopentadecanone、heptadecane、dibutyl phthalate；ZK7单独培养时产生的挥发性物质包括acetic acid、hexanal、2-amino-6-methylbenzoic acid、benzaldehyde、1,3-dimethoxy-benzene、(Z)-9,17-octadecadienal；B16与ZK7共培养时产生的新挥发性物质包括pentane、piperazine、3-aminopyrrolidine、trichloromethane、(E)-2-pentenal、3-hydroxy-2-butanone、toluene、butyrolactone、1-ethynyl-4-methyl-benzene、1-methyl-4-piperidinemethanol、benzocycloheptatriene、2-octyl-cyclopropaneoctanal。

表1 B16、ZK7单独培养及共培养时产生的挥发性物质

2.3 促产孢挥发性物质的验证结果(图2)

从图2a可以看出，加入不同浓度的丁内酯，ZK7的产孢量均比空白对照高；并且随着丁内酯浓度的增加，ZK7的产孢量逐渐升高，当加入1.0 mg·mL-1丁内酯培养72 h时，ZK7的产孢量提高了262.00%。表明丁内酯能促进ZK7产孢。

从图2b可以看出，加入不同浓度的甲苯，ZK7的产孢量均比空白对照低；并且随着甲苯浓度的增加，ZK7的产孢量不断降低，当加入1.0 mg·mL-1甲苯培养72 h时，ZK7的产孢量降低了74.62%。这说明甲苯不能促进ZK7产孢，而且过多的甲苯对ZK7产孢具有抑制作用。

图2 丁内酯(a)和甲苯(b)对ZK7产孢量的影响

2.4 讨论

Kerry[24]认为衡量一株生防真菌生防潜质的重要标准包括：菌株的产孢能力、对根结线虫卵的侵染能力以及菌株的定殖能力(包括根际土壤及植物根内的定殖量)。从B16对ZK7的关键生防因子的测试可知，B16能促进ZK7分生孢子的产生。产孢能力的提高，有利于ZK7在土壤中能更好地定殖，从而增加ZK7侵染根结线虫卵几率，提高ZK7对根结线虫的生物防治效果。厚垣普可尼亚菌的一个优势在于分生孢子能抵御外界环境的不良影响，具有繁殖能力，芽孢杆菌可以促进厚垣普可尼亚菌产孢，提高分生孢子的产量，促产孢应该只是芽孢杆菌提高厚垣普可尼亚菌防治效率的因素之一。

与单独培养相比，混合共培养时，B16发酵液与ZK7发酵液的最佳比例为1∶7，排除培养基的影响后，能使ZK7的产孢量最高提高183.17%。B16与ZK7共培养后产生了新的挥发性物质，其中丁内酯被证明与曲霉分生孢子的产生有关。Schimmel等[25]研究了丁内酯对曲霉分生孢子的影响，发现500 μmol·L-1的丁内酯能使曲霉的产孢量提高3倍。本研究结果表明，丁内酯对ZK7的产孢能力具有促进作用，产孢量随着丁内酯浓度的增加逐渐升高，而甲苯对ZK7的产孢能力没有促进作用。

3 结论

研究了芽孢杆菌B16对根结线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌ZK7产孢能力的影响，发现芽孢杆菌B16能显著提高厚垣普可尼亚菌ZK7的产孢量；芽孢杆菌B16发酵液与厚垣普可尼亚菌ZK7发酵液共培养产生的丁内酯能促进ZK7产孢，产生的甲苯对厚垣普可尼亚菌ZK7的产孢能力没有促进作用。芽孢杆菌B16与厚垣普可尼亚菌ZK7联合进行生物防治可应对土壤环境的多样性，其防治效果比单一菌剂有所提高。