氨基酸序列比对分析IL-12的种属特异性

陈丽娜，王建刚，王亚俊，秦 欢，丁会芹,*

(1.康立泰生物医药(青岛)有限公司，山东 青岛 266112；2.青岛大学，山东 青岛 266001)

目前市场上尚未有任何一种上市药物能够单品种、单次剂量实现抑制肿瘤细胞生长，调节免疫功能且能够同时促进全血象恢复。临床上常需将多种药物或治疗方式联合，治疗方案复杂且效果有限。白介素-12(interleukin-12，IL-12)是一种具有多种生物学功能的细胞因子，具有明确的免疫调节、抑制肿瘤细胞生长功能，是迄今为止发现的唯一能够促进造血功能全面恢复的细胞因子类药物[1]。IL-12同时具有抗肿瘤[2]、免疫调节[3]及血象恢复[4]等作用，能够填补临床治疗的空白。重组人白介素-12(rhIL-12)产品在全球范围内还未上市，是真正意义上的国家一类创新药物，其市场潜力巨大。rhIL-12蛋白结构与天然IL-12的一致，是由α亚基和β亚基经1个二硫键共价结合而成的异二聚体糖蛋白。α亚基由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的N-连接糖基化位点；β亚基由306个氨基酸组成，包括10个半胱氨酸残基和4个潜在的N-连接糖基化位点[5]。

生物技术药物的生物学活性通常与种属和/或组织特异性相关，因此应进行报审前的非临床药效研究及安全性评价，以阐明药理学及毒理学等特征[6]。这就需要确定能够预测临床风险的相关种属或动物模型，在进行非临床药效研究和安全性评价前，需关注种属间IL-12氨基酸序列的特异性及其同源性，并进行氨基酸信息学比对分析。为此，作者通过UniProt数据库检索人、鼠、兔、犬和猴的IL-12氨基酸序列，运用ClustalW及Espript软件进行两序列比对，运用Blat数据库进行多序列比对，为IL-12产品以及相关衍生产品的非临床研究和评价中动物种属的选择提供依据，以指导新药产品的注册申报。

1 实验

1.1 材料

在UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)分别输入关键词“IL-12 α”和“IL-12 β”，获得蛋白质氨基酸序列，选择小鼠、大鼠、兔、犬、食蟹猴及人的IL-12氨基酸序列，排除“同物种序列”、“相似序列”及其它不相关序列；其中，人IL-12氨基酸序列去除信号肽序列。

1.2 方法

采用ClustalW及Espript软件将获取的人IL-12氨基酸序列与各种属IL-12氨基酸序列进行两序列比对。即分别将人与另一种动物的IL-12氨基酸序列复制到ClustalW软件中，点击“Execute Multiple Alignment”运行软件，获得两序列比对文件，将所得文件上传至Espript软件，点击“Submit”获得两序列比对结果文件。

采用Blat数据库(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)依次选择小鼠、大鼠、兔、犬、恒河猴、食蟹猴数据库并输入获取的人IL-12氨基酸序列，点击“Submit”运行数据库，进行多序列比对；另外，选择人数据库并输入获取的5种动物种属的IL-12氨基酸序列，运行数据库进行多序列比对。完成比对后，分析人IL-12与各种属IL-12的同源性差异。

2 结果与讨论

2.1 各种属IL-12氨基酸序列检索结果

在UniProt数据库检索到与IL-12 α亚基氨基酸相关序列共435个，与IL-12 β亚基氨基酸相关序列共737个，排除“同物种序列”、“相似序列”及其它不相关序列。选择非临床研究中常用5种动物的IL-12 α亚基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43431)、大鼠(rat，Q9R103)、兔(rabbit，A0A5F9CIX7)、犬(dog，F1PPC0)、食蟹猴(crab-eating macaque，A0A2K5V4L8)；选择5种动物的IL-12 β亚基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43432)、大鼠(rat，Q9R278)、兔(rabbit，G1TBD7)、犬(dog，F1PK70)、食蟹猴(crab-eating macaque，G7P6S2)。选择人的IL-12 α亚基(human，p29459)及IL-12 β亚基(human，p29460)氨基酸序列，去除信号肽序列，即分别为197个氨基酸的IL-12 α亚基及306个氨基酸的IL-12 β亚基。

2.2 两序列比对结果

采用ClustalW及Espript软件比对人与5种动物的IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列，两序列比对结果见表1。

表1 人与5种动物的IL-12氨基酸序列比对结果/%

相似性数值越大，表明同源性越高。由表1可以看出，IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列同源性在人与小鼠之间分别为80.47%、84.84%，在人与大鼠之间分别为81.40%、84.37%，在人与兔之间分别为88.81%、91.01%，在人与犬之间分别为90.32%、91.95%，在人与食蟹猴之间分别为87.15%、95.88%。其中，人与食蟹猴的IL-12氨基酸序列同源性相对较高。

人与食蟹猴的IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列比对见图1。

注：深色背景序列表示人与食蟹猴相同的IL-12氨基酸序列

2.3 多序列比对结果

采用Blat数据库，比对人IL-12与6种动物数据库的氨基酸序列，结果见表2。

表2 人IL-12与6种动物数据库的氨基酸序列比对结果

得分越高，种属一致性越高。由表2可以看出，人的IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列与恒河猴的一致性分别高达94.0%、96.2%，与食蟹猴的一致性分别高达92.8%、96.2%，与其它种属的一致性相对较低。选择人IL-12 β亚基氨基酸序列与食蟹猴数据库比对时，产生了4个食蟹猴氨基酸的匹配位置数据，第一个匹配数据表2中有显示，另外3个得分都很低，并且跨度≤15 bp(base pair，碱基对)，虽然一致性均为100%，但这些匹配可能具有偶然性，不能代表人的IL-12 β亚基氨基酸序列与此位置有真正关系。

采用Blat数据库，比对5种动物IL-12与人数据库的氨基酸序列(表3)。分析一致性发现，5种动物的IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列与人的一致性大小顺序依次为食蟹猴>犬>兔>大鼠>小鼠。

表3 5种动物IL-12与人数据库的氨基酸序列比对结果

2.4 讨论

IL-12是一种异源二聚体蛋白，具有与二硫键共价结合的α亚基和β亚基，是一种有效的抗肿瘤药物。能够通过刺激CD8+T细胞的细胞毒性，诱导Th1细胞分化，刺激抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈作用，促进NK细胞、T细胞等IFN-γ分泌作用，抑制肿瘤血管生成等多种途径增强机体免疫系统的肿瘤免疫作用，甚至可通过免疫调节诱导机体产生自身抗肿瘤的“远端效应”和“免疫记忆”[7-9]。目前，已证实IL-12是唯一能够促进骨髓造血系统全血象长久恢复的细胞因子，也是唯一能在辐射后24 h给药仍然显示全血象恢复功能的细胞因子[10-11]。IL-12还具有抗病毒[12]、抗肝炎[13]、抗寄生虫[14]、抗哮喘[15]等多种生物学活性，其通过一系列复杂的作用机制来发挥作用。

多数生物技术药物在蛋白质水平具有严格的种属特异性，导致相应的一般药理学、药代动力学、药效学评价及毒理学研究都存在种属特异性问题。因而此类药物的非临床研究及安全性评价的主要挑战就是确定相关种属或动物模型。采用相关种属进行非临床研究及安全性评价有助于预测产品在临床试验中可能出现的治疗效果及不良反应。

3 结论

分别采用了两序列比对及多序列比对的方式进行氨基酸序列比对，虽然不同方式得出的一致性数据存在差异，但总体上，人的IL-12 α亚基及IL-12 β亚基氨基酸序列与常用种属的同源性大小顺序均为猴源>犬源>兔源>鼠源。即人的IL-12氨基酸序列与恒河猴、食蟹猴的一致性较高，与其它种属的一致性普遍较低，因此存在种属特异性。研究结果提示，IL-12产品以及相关衍生产品的药理、药效研究以及需种属相关性动物进行的安全性评价应该在食蟹猴或恒河猴身上进行，才能获得有意义于申报临床及上市的试验结果。