碱提酸沉法提取玉米须芦丁的工艺优化

张跃彬，王玉荣，王振宇，马成可，史雅静

(辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁 本溪 117004)

玉米须为禾本科植物玉米雌穗的花柱及柱头，在玉米籽粒的生长过程中作为传粉受精的媒介和通道[1]。玉米须含有多种活性成分，如黄酮类化合物、皂甙、植物甾醇、氨基酸和有机酸等[2]。在玉米干品各组织中，玉米须中的黄酮类化合物含量最高[3]。芦丁属于黄酮类化合物，广泛存在于各类植物中，如自芸香叶、烟叶、橙皮、玉米须、荞麦花等。芦丁作为一种维生素类药物，具有抗病毒、抗自由基活性、抗脂质过氧化、提高机体免疫防御、抑制醛糖还原酶等作用[4-5]，能降低毛细血管的脆性和通透性，保持和恢复毛细血管的正常弹性，主要用于辅助治疗高血压等心血管疾病。芦丁对紫外线有较强的吸收作用，可用作防晒霜的主要成分；另外还可以用作食品添加剂和食用色素等[6]。

芦丁的提取方法较多，常用的有有机溶剂提取法、超声波提取法、酶提取法、碱提酸沉法、超临界萃取法等[7]。其中碱提酸沉法相较于其它方法，具有经济、安全、提取率高等优点。芦丁含有酚羟基，易溶于含有羟基的碱性水溶液或碱性稀醇溶液。碱提酸沉法是将含芦丁物质溶解于碱性水溶液中，再加酸沉淀析出粗芦丁。作者以玉米须为原料，采用碱提酸沉法提取玉米须芦丁，在单因素实验的基础上，分别通过正交实验和响应面法考察料液比、水浴温度、水浴时间等因素对玉米须芦丁提取率的影响，并对正交实验和响应面法优化的提取工艺进行比较，为碱提酸沉法提取玉米须芦丁的工艺研究和实际生产应用提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

玉米须，采自内蒙古通辽市郊区。将玉米须清洗去尘，干燥，用粉碎机粉碎过筛(40目)后，置于阴凉干燥处保存。

芦丁标准品(纯度>98%)，西安开来生物工程有限公司；无水乙醇、石灰水、硼砂、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯。

FZ-06型中药粉碎机，浙江温岭百乐粉碎设备厂；TU-1900型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；GL-21M型高速冷冻离心机；HH-6型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；多功能智能pH检测仪。

1.2 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁标准品20 mg置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶解并定容至刻度，参照文献[8-9]，采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定吸光度。以芦丁浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为：A=11.345c-0.0118，R2=0.9984。

1.3 玉米须芦丁的提取及提取率的测定

精密称取2.0 g玉米须置于50 mL三角瓶中，加入0.1 g硼砂，按料液比1∶10(g∶mL，下同)加入20 mL蒸馏水，置于沸水中煮沸，降温，调节pH值至8，70 ℃水浴加热40 min后，6 000 r·min-1离心10 min，即得玉米须提取液。

取1 mL玉米须提取液，加水定容至50 mL，按1.2方法测定吸光度，依据线性回归方程计算芦丁浓度，按下式计算芦丁提取率(%)：

式中：c为提取液中芦丁浓度，g·mL-1；n为稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为玉米须质量，g。

1.4 玉米须芦丁提取工艺的优化

以芦丁提取率为评价指标，采用单因素实验考察料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶35)、水浴温度(60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃)、水浴时间(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、pH值(7、8、9、10、11)对碱提酸沉法提取玉米须芦丁的影响。根据单因素实验结果，选取料液比、水浴温度和水浴时间为自变量，芦丁提取率为响应值，分别进行正交实验和响应面实验，进一步优化提取工艺。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果(表1)

表1 单因素实验结果

由表1可知：(1)随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，玉米须芦丁提取率呈先上升后下降的趋势；在料液比为1∶20时，芦丁提取率最高，这可能与提取溶剂和芦丁的接触面积、芦丁溶解度相关[10-11]。故料液比以1∶20为宜。(2)随着水浴温度的升高，玉米须芦丁提取率呈先上升后下降的趋势；在水浴温度为80 ℃时，芦丁提取率最高，此时玉米须的细胞壁被破坏较完全[12]，芦丁的可溶解性成分释放基本达到稳定，若继续升高水浴温度，活性物质可能被破坏，芦丁提取率反而会下降[10]。故水浴温度以80 ℃为宜。(3)随着水浴时间的延长，玉米须芦丁提取率呈先上升后下降的趋势；在水浴时间为40 min时，芦丁提取率最高。故水浴时间以40 min为宜。(4)随着pH值的增大，玉米须芦丁提取率呈先上升后下降的趋势，当pH值为8时，芦丁提取率最高。故pH值以8为宜。

2.2 正交实验结果(表2)

表2 正交实验结果与分析

由表2可知，各因素对玉米须芦丁提取率的影响大小依次为：料液比>水浴温度>水浴时间；最优提取工艺为A1B2C2，即料液比1∶15、水浴温度80 ℃、水浴时间40 min。在最优工艺条件下进行3次验证实验，玉米须芦丁提取率平均值为5.8945%。

2.3 响应面实验结果

2.3.1 回归模型的建立与分析

利用Design-Expert 8.0.6.1软件进行Box-Behnken设计响应面实验，结果见表3。

对表3数据进行拟合，得到多元二次回归模型方程：Y=6.20-1.47A+1.627×10-3B+0.014C-0.24AB-0.011AC+0.11BC-1.51A2-1.08B2-0.88C2。回归模型的方差分析见表4。

表3 响应面实验设计与结果

表4 回归模型的方差分析

2.3.2 响应面分析

料液比、水浴温度、水浴时间的交互作用对芦丁提取率影响的响应面图及等高线图见图1。

图1 各因素交互作用对玉米须芦丁提取率影响的响应面图和等高线图

由图1可知，响应曲面均为开口向下的凸形曲面，说明响应值存在极高值；等高线中心均位于编码值区域内，且中心点位于颜色较深的区域，说明玉米须芦丁提取的最优条件存在于实验所设计的因素与水平范围内。

由图1a可知，水浴温度和水浴时间的曲面均较平缓，对芦丁提取率的影响不显著。水浴温度的曲面比水浴时间的曲面陡，等高线沿水浴温度比轴向比水浴时间稍微密集，表明水浴温度对芦丁提取率的影响比水浴时间大。等高线为圆形，说明水浴时间与水浴温度的交互作用较弱，对芦丁提取率的影响不显著。

由图1b可知，料液比的曲面较陡，水浴时间的曲面较平缓，说明料液比对芦丁提取率的影响显著；等高线沿料液比比轴向比水浴时间密集，表明料液比对芦丁提取率的影响比水浴时间大。等高线的形状为椭圆形，说明料液比与水浴时间有交互作用，但对芦丁提取率的影响不显著。

由图1c可知，料液比的曲面较陡，水浴温度的曲面较平缓，说明料液比对芦丁提取率的影响显著；等高线沿料液比比轴向比水浴温度密集，说明料液比对芦丁提取率的影响比水浴温度大。等高线的形状为椭圆形，表明料液比与水浴温度有交互作用，但对芦丁提取率的影响不显著。

综上，各因素对玉米须芦丁提取率的影响大小为：料液比>水浴温度>水浴时间，与方差分析结果一致。通过软件对模型极值求解和等高线分析，得出玉米须芦丁的最优提取工艺为：料液比1∶17、水浴温度85 ℃、水浴时间40 min。在最优工艺条件下进行验证实验，玉米须芦丁提取率平均值为6.5328%，与理论最大值6.5649%非常接近。说明模型优化的提取工艺切实可行，用响应面法对玉米须芦丁提取工艺进行优化是合理的。

2.4 正交实验与响应面法优化玉米须芦丁提取工艺比较

通过正交实验和响应面法分析发现，两种方法分析各因素对玉米须芦丁提取率的影响结果基本一致，即料液比>水浴温度>水浴时间，但采用响应面法优化得出的提取工艺条件更精确，且提取率更高。因此，采用响应面法优化玉米须芦丁的提取工艺更合适。这与黄菊等[13]的研究结论一致，认为正交实验无法获得整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值[14]，而响应面法能够克服这一缺点，可作为该类实验优化的参考依据。

3 结论

以玉米须为原料，采用碱提酸沉法提取玉米须芦丁，在单因素实验的基础上，分别通过正交实验和响应面法考察了料液比、水浴温度、水浴时间等因素对玉米须芦丁提取率的影响。结果表明：两种方法分析各因素对玉米须芦丁提取率的影响结果基本一致，即料液比>水浴温度>水浴时间。正交实验确定的最优工艺为：料液比1∶15(g∶mL)、水浴温度80 ℃、水浴时间40 min，玉米须芦丁提取率为5.8945%；响应面法确定的最优工艺为：料液比1∶17(g∶mL)、水浴温度85 ℃、水浴时间40 min，玉米须芦丁提取率为6.5328%。响应面法优化的玉米须芦丁提取率优于正交实验优化的，因此选择响应面法确定的最优工艺提取玉米须芦丁。