基于PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1通路分析沉默miR-664-3p对去卵巢骨质疏松大鼠的干预作用

胡广 关智宇 张开伟

(贵州中医药大学第一附属医院骨科，贵州 贵阳 550001)

骨质疏松是临床常见的骨科疾病，属于系统性代谢性疾病，主要以骨密度降低、骨量减少、固位结构退化等为表现特征〔1,2〕。女性骨质疏松发病率高于男性，且多发于中老年绝经后妇女，因此又被称为绝经后骨质疏松。绝经后骨质疏松与绝经后雌激素水平下降及生理性衰退等因素有关，是由多种因素导致骨重建速度降低、骨代谢失衡、骨微结构改变所致〔3,4〕。有研究表明，骨髓基质细胞增殖能力及分化成骨细胞能力在骨质疏松患者中明显下降〔5〕。作为调控成骨细胞、破骨细胞功能喜好通路网络中心，磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号对维持骨组动态平衡具有重要作用，而PI3K/Akt/糖原合成酶(GSK)3β/活化T细胞核因子(NFATc1)信号通路在破骨细胞分化、形成过程中具有重要意义〔6〕。miRNAs在骨质疏松中出现异常表达，但其是否能够有效控制成骨分化及骨骼形成，仍值得深究〔7〕。本研究通过PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1通路观察沉默miR-664-3p对去卵巢骨质疏松大鼠的干预作用。

1 材料与方法

1.1材料 研究动物：选取30只健康SD雌大鼠，来源于北京微通利华实验动物技术有限公司。鼠龄8～13 w，平均鼠龄(10.5±3.1)w，体重228～267 g，平均体重(247.5±16.5)g。在相对温度(35±2)℃，湿度35%～45%，12 h光照昼夜交替照明环境下喂养1 w，给予标准鼠科动物饲料，不限制饮水与饮食。本文研究获得医院伦理委员会批准。

主要试剂：兔抗小鼠骨钙素抗体购自Dako公司；碱性磷酸酶(ALP)抗体购自碧云天公司；小鼠抗兔PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1抗体购自BD公司；酶联免疫吸附试验试剂盒购自慧嘉生物；骨密度检测仪购自南京博克纳自动化系统有限公司；Micro-CT购自无锡怀信生物医药科技有限公司。

1.2方法

1.2.1建模分组 随机选取10只大鼠作为正常组，剩余20只建立去卵巢骨质疏松模型。对所有大鼠使用戊巴比妥钠行腹腔麻醉，俯卧位固定，去除大鼠卵巢组织，术后10 w检测所有大鼠骨密度，对未发生骨质疏松的大鼠进行筛选。最终建模成功17只，将17只去卵巢骨质疏松模型大鼠随机分为模型组9只，沉默组8只。沉默组大鼠使用10 mg/kg antago miR-664-3p灌胃干预，对正常组、模型组采用同等剂量的生理盐水灌胃。各组大鼠连续干预10 w。

1.2.2苏木素-伊红(HE)染色 取大鼠左后肢全骨，置于10%中性甲醛溶液内加固，使用10%EDTA-NA缓冲液进行脱钙处理，梯度乙醇脱水，使用石蜡纵向包埋，进行常规切片，使用HE染色，光学显微镜下进行病理观察。

1.2.3全骨髓法体外培养骨髓基质细胞(BMSCs) 分离细胞，在37℃环境下，于0.5%CO2培养箱中进行培养，每3 d换液1次。当原代细胞集落处细胞密度达到密集状态时，使用0.25%胰酶消化传代。取每组第3代BMSCs，计数后将浓度调至4×104个/ml，培养基调整为1%FBS，铺96孔。每组细胞设立复孔，于接种后0～6 d使用CCK-8对每组细胞450 nm波长处吸光值进行检测，每次检测3个复孔。

1.2.4检测骨密度、股骨微结构 连续干预10 w后，将大鼠麻醉，对大鼠右侧股骨密度进行检测。对大鼠行Micro-CT扫描检测骨微结构，骨折线上下各200层为扫描范围，之后使用NRecon软件对断层图像进行三维重建，使用CT Analyser软件采集骨体积分数(BV/TV)、骨痂骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.2.5采用酶联免疫吸附试验对骨钙素(OC)水平进行检测 将待测标本置于室温后，标记酶标板，制作标准品，然后取出试剂盒，按照1∶2比例对样品进行稀释，将标准品100 μl/孔和待测血清依次加入反应孔中，在37℃恒温孵育箱内湿育2 h，后使用专用洗涤剂清洗3次，再加入抗体工作液(1∶100倍稀释后)100 μl/孔，再次置于37℃孵育箱内湿育45 min，对反应板洗涤4次，于每孔加入TMB溶液100 μl/孔，再次置于孵育箱内湿育45 min，加入终止液100 μl/孔终止反应，在450 nm波长测定吸光度，经绘制标准曲线计算OC水平。

1.2.6免疫透射比浊法检测ALP含量 取3个试管标记为空白管、测定管、标准管，随后均加入300 μl缓冲液，在空白管、测定管、标准管中分别加入20 μl蒸馏水、20 μl血清、20 μl APL标准液。对3个试管均匀晃动后，放置常温环境下5～10 min，使用分光光度计对其进行比色，在500 nm波长处以空白管调零下，记录吸光度，最后对ALP水平进行计算。

1.2.7实时荧光定量PCR检测法检测miR-664-3p表达量 提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，采用2-△△Ct方法计算，内参U6。设置反转录反应条件：25℃ 10 min,40℃ 60 min,85℃ 5 min；设置扩增条件:94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35个循环，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的miR-664-3p表达量。miR-664-3p引物序列：上游引物：5'-TATTCATTTACTCCCCAGCCTA-3'，下游引物：5'-TATTCATTTATCCCCAGCCTACA-3'。

1.2.8Western印迹法检测对各组PIK3、Akt、GSK3、NFATc1水平 采用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗标本，随后裂解30 min，测定其蛋白浓度。取得20 μg/孔蛋白质进行电泳，同时加入蛋白缓冲液，10 min后把电转膜放置于浓度10%牛奶中浸泡，常温环境下封闭2 h。封闭后结合-抗孵育1 d，次日取出，使用TBST液进行冲洗，结合二抗。1 h后进行清洗、显色，对蛋白PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表达进行检测。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行重复测量数据方差分析、F检验、独立t检验。

2 结 果

2.1去卵巢骨质疏松大鼠股骨微结构 正常组大鼠股骨微结构骨小梁厚度、数量均处于正常阶段,骨小梁有成骨细胞排列。模型组大鼠股骨微结构骨小梁厚度明显降低，骨小梁数量大幅度减少，骨髓腔变大，成骨细胞边界模糊。沉默组大鼠股骨微结构骨小梁厚度较模型组有所增厚，骨小梁数量增多，骨髓腔变小，可见骨原细胞，但还未达到正常大鼠股骨微结构骨小梁厚度、数量。见图1、图2。

图1 各组股骨微结构(×200)

图2 各组骨组织病理(HE，×200)

2.2去卵巢骨质疏松大鼠模型骨细胞指数、骨密度 正常组骨细胞指数、骨密度均显著高于模型组、沉默组(P<0.05)；模型组骨细胞指数、骨密度显著低于沉默组(P<0.05)。见表1。

表1 各组骨细胞指数和骨密度及股骨微结构比较

2.3各组去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨微结构 模型组及沉默组Tb.N、Tb.Th、BV/TV均显著低于正常组，Tb.Sp高于显著正常组(P<0.05)；沉默组Tb.N、Tb.Th、BV/TV均显著高于模型组；Tb.Sp显著低于沉默组(P<0.05)。见表1。

2.4血清OC、ALP水平比较 模型组OC、ALP水平均显著高于正常组(P<0.05)；沉默组血清OC、ALP水平显著低于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 各组血清OC、ALP水平及miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表达

2.5各组miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1表达 沉默组及模型组miR-664-3p、PI3K、Akt、NFATc1表达均显著高于正常组(P<0.05)，GSK3β表达显著低于正常组(P<0.05)；沉默组miR-664-3p、PI3K、Akt、NFATc1表达均显著低于模型组，GSK3β表达显著高于模型组(P<0.05)。见表2，图3。

图3 各组miR-664-3p、PI3K、Akt、GSK3β、NFATc1蛋白表达

3 讨 论

近年来，随中国人口老龄化加重，骨质疏松发病率呈逐年上升趋势〔8,9〕。卵巢功能退化、雌性激素水平下降是导致绝经后骨质疏松发生的主要原因。绝经后妇女骨质疏松属于一种高转化型骨质疏松，临床研究显示，去卵巢建立的骨质疏松模型是目前临研究绝经后骨质疏松的经典方法〔10，11〕。本文研究中以SD雌性大鼠去卵巢后建立去卵巢骨质疏松大鼠模型，模型组大鼠骨质密度明显降低证明造模成功。

骨密度、骨细胞指数是诊断卵巢骨质疏松症状及评价骨质疏松性骨折治疗效果的临床常用指标〔12，13〕。龚庆等〔14〕研究显示，去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度下降，对其进行有效的干预后骨密度上升，说明骨密度和卵巢骨质疏松症状有着密切的关联。本文研究中发现，去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度明显下降，与上述一致。对其进行沉默miR-664-3p干预后发现，去卵巢骨质疏松大鼠骨密度出现明显的提升，说明miR-664-3p沉默后，能够改善去卵巢骨质疏松大鼠骨密度和骨细胞指数，对去卵巢骨质疏症状有着一定的改善作用。

OC是一种非胶原酸性糖蛋白，是一种维生素K依赖性钙结合蛋白，其主要是由成骨细胞、成牙质细胞合成来。OC在调节骨钙代谢中有着重要的作用，是一种研究骨代谢的生化标志物之一〔15，16〕。ALP是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，在临床上ALP主要用于对骨骼、肝胆疾病的鉴别诊断〔17〕。本文研究说明沉默miR-664-3p能够通过调节OC、ALP水平，而起到的治疗去卵巢骨质疏松效果。

临床研究表明，在所有的生理病理过程中miRNA几乎全部参与，在骨质疏松中其存在异常表达〔18〕。研究证实，miR-664-3p参与ICA介导的成骨细胞分化，miR-664-3p能够有效抑制成骨细胞分化，其沉默表达引起PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路表达下降，进而导致骨质疏松的发生〔19〕。PI3K/Akt信号通路是细胞增殖、转移、黏附及死亡过程中的重要调节者，在正常的生理条件下，PI3K/Akt信号通路能够选择性的影响成骨、破骨细胞的生理功能，能够维持骨组织的动态平衡。RANKL、M-CSF两个因子在破骨细胞的形成过程中有关键性作用，其中RANKL因子是破骨细胞形成的主要调节者。PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路在RANKL引起的破骨细胞形成和分化中起重要作用〔20，21〕。本文研究结果显示，沉默miR-664-3p干预对PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路进行调控可能是抑制骨质疏松的一种潜在机制。

综上，沉默miR-664-3p干预可能通过调控PI3K/Akt/GSK3β/NFATc1信号通路促进骨髓基质细胞的增殖、抑制层骨细胞的凋亡，从而发挥抑制骨质疏松的作用。