mTOR信号通路在DDC诱导的胆管损伤中的作用

杨慧敏 周倩扬 李静 武靖 徐娜 刘继鑫 张蓓蓓 颜超 郑葵阳 于倩

(徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室 江苏省免疫与代谢重点实验室，江苏 徐州 221004)

胆管上皮细胞因先天性、遗传性、寄生虫性、肿瘤性等因素导致胆管反应(DR)分泌不同的细胞因子和相关蛋白，进而诱发一系列反应，包括细胞增生、自噬、衰老甚至癌变〔1～4〕。DR引发的疾病包括：胆道华支睾吸虫病、原发性胆汁性肝硬化、胆道闭锁等。胆管增生是肝胆疾病的早期表现。早期在受到外界刺激、损伤和其他因素作用时，胆管上皮细胞增生，其后发生胆管周围纤维组织增生〔5～7〕，纤维组织增生又刺激胆管细胞形态发生肥大、化生、萎缩、消失等改变，很多在汇管区的增生和纤维化病灶逐渐连接起来，形成早期肝硬化的病变趋势。因此，胆管损伤增生已成为免疫系统疾病研究的新热点〔8〕。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，通过形成两个多蛋白复合物mTORC1和mTORC2来调控细胞的生长、运动和代谢。mTORC1对营养物质敏感，mTORC2通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和生长因子信号通路等参与细胞代谢调控〔6〕。文献报道显示mTORC1通过促进下游分子如核翻译起始因子4E结合蛋白(4E-bp)1和p70核糖体S6激酶(p70S6K)的磷酸化启动mRNA翻译。mTORC2通过磷酸化一些环腺苷酸端依赖蛋白激酶(AGC)激酶〔如蛋白激酶B(Akt)和血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)〕的c端疏水基序，对生长因子信号传递发生应答。PI3K/Akt/mTOR信号轴调控多种生理功能，包括细胞周期进展、转录、mRNA翻译、分化、增生、凋亡、自噬、运动和代谢。然而mTOR信号通路在3，5-二乙氧基羰基-1,4-二氢-尿嘧啶(DDC)诱导的胆管损伤中的重要性尚未阐明〔8,9〕。Torin1是mTOR的抑制剂，Torin1通过耐雷帕霉素机制引起细胞周期阻滞，可分别抑制mTORC1 和mTORC2底物的磷酸化〔10〕。本研究通过Torin1抑制mTOR信号通路，拟阐明mTOR信号通路在DDC诱导的胆管损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF 级 C57BL/6J雌鼠，6～8周龄，体重20～30 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司〔SCXX(京)2016-0002〕。饲养于徐州医科大学实验动物中心〔SYXK(苏)2015-0030〕。自由摄食和饮水，每 2 d 更换一次饮水瓶，每4 d 更换一次垫料，室温保持在22～25℃，相对湿度(55±10)%，每天光照 12 h 左右。所有实验符合徐州医科大学实验动物伦理学要求(审批号：201801w003)。

1.2实验试剂 Anti-Akt(华安生物技术有限公司，ETI609-47)，Anti-pSer473-Akt(华安生物技术有限公司，ETI607-73)，Anti-mTOR(华安生物技术有限公司，ETI608-5)，Anti-磷酸化(p)-mTOR(ABclnal，4000000094)，Anti-P65(Abcam，ab32536)，Anti-p-P65(bioworld，BS4137)，Anti-细胞角蛋白(CK19)(Abcam，ab7755)，Anti-Ki67(Cell Signaling Technology，#12202)，DDC (北京科澳协力饲料有限公司)，Torin1(MCE，HY-13003)，鼠二抗 (凯基，SA00001-1)，兔二抗 (凯基，SA00001-2)，小鼠二步法检测试剂盒 (北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9002)，兔二步法检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，PV-9001)。

1.3实验仪 正置显微镜(Olympus 公司，日本)，制冰机 (Scotsman公司，中国) 实时荧光定量PCR仪〔罗氏诊断产品(上海)有限公司，德国〕，石蜡切片机(Leica 公司，德国)，5804R 高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)，-80℃ 超低温冰箱(Thermo 公司，德国)，BMJ-B包埋机(常州市中威仪器有限公司，中国)。

1.4动物分组及实验干预 实验动物分组与模型的建立：Torin1按说明书溶于N-甲基吡咯烷酮(NMP)，储存浓度为30 mg/ml。 24只雌性C57BL/6J小鼠随机分为4组；NMP溶剂组(NMP组)、mTOR抑制剂Torin1处理组(Torin1组)、NMP+DDC组、Torin1+DDC组，每组6只。DDC组及Torin1+DDC组给予0.1% DDC饲料喂养3 w； NMP溶剂组及NMP+DDC组给予等量NMP。Torin1组及Torin1+DDC组均隔天腹腔注射Torin1(10 mg/kg)，连续3 w。此期间对照组每天腹腔注射 0.1% NMP。最后一次注射 Torin1 24 h后进行取材及相关检测。

1.5Western印迹检测mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt(Ser473)、p65、p-p65 蛋白表达 提取各组肝脏组织总蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法测浓度，每孔取40 μg蛋白样品上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，用Bio-Rad 标准转膜装置进行湿式转膜，5%脱脂牛奶室温封闭 2 h，一抗 4℃冰箱摇床孵育过夜，洗膜，二抗孵育室温2 h，洗膜，加电化学发光(ECL)显影液曝光显影，用ImageLab软件分析结果。

1.6苏木素-伊红(HE)及Masson染色观察 小鼠肝脏组织于4%中性甲醛中固定约48 h后经脱水、石蜡包埋制成组织石蜡切片，HE及Masson 染色，于光学显微镜下观察肝脏炎症浸润及纤维化情况，并进行半定量计分评价。

1.7免疫组化检测CK19、Ki67等指标 微波处理(0.01 mmol/L 柠檬酸盐缓冲液，pH6.0)石蜡切片(4 μm厚)，用5%牛血清蛋白(BSA)室温封闭样本组织30 min,使用单克隆小鼠抗CK19、Ki67抗体(稀释 1∶100)，对照组滴加1% BSA，置于湿盒中4℃过夜。于第2天取出玻片，滴加预先按说明书稀释的二抗，将玻片置于湿盒中，放于37℃温箱静置30 min。水洗后二氨基联苯胺(DAB)显色并终止，苏木素复染后封片。于光学显微镜下观察阳性分布情况，并用ImageJ定量分析。

1.8qRT-PCR检测白细胞介素(IL)-6、 单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-10、精氨酸(Arg1)等指标 检测IL-6、 MCP-1、IL-10、Arg1的mRNA表达水平。用Trizol法按说明书步骤提取各组肝组织的总RNA，将RNA逆转录成cDNA后进行PCR扩增反应。以β-actin作为内参，目的基因mRNA表达量用2-ΔΔCt计算，引物序列：β-actin正义链：5'-AACTCCATCATGAAGTGTGA-3'，反义链：5'-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3'；IL-6正义链：5'-TCACAGAAGGAGTGGCTAAGGACC-3'，反义链：5'-ACGCACTAGGTTTGCCGAGTAGAT-3'；MCP-1正义链：5'-TTAAAAACCTGGATCGGAACCAA-3'，反义链：5'-GC-ATTAGCTTCAGATTTACGGGT-3'；IL-10正义链：5'-GGAAGACAATAACTGCACCCACT-3'，反义链：5'-CAACCCAAGTAACCCTTAAAGTCC-3'；Arg1正义链：5'-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3'，反义链：5'-TCTCTTCCATCACCTTGCCAATCC-3'。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prism8软件进行单因素方差分析、独立样本t检验。

2 结 果

2.1肝脏大体观 与NMP组相比，NMP+DDC组小鼠肝脏明显淤血肿大，Torin1+DDC组可以明显减轻DDC引起的体重下降及肝脏淤血肿大程度。见图1。

2.2各组ALT、ALP和TBIL水平 NMP+DDC组血清中ALT、ALP和TBIL表达较NMP组及Torin1组显著升高(P<0.01)，Torin1+DCC组与NMP+DDC组比较可以一定程度降低ALT、ALP和TBIL的含量，但只有ALT差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3Western印迹检测各组肝脏组织mTOR、Akt、p65的磷酸化水平 与NMP组和Torin1组相比，NMP+DDC组蛋白磷酸化水平明显升高，而Torin1+DDC组磷酸化水平相比NMP+DDC组显著降低。见表1、图2。

图2 各组肝脏组织mTOR、Akt、p65磷酸化表达

表1 各组ALT、ALP、TBIL、p-mTOR、p-Akt、p-p65水平比较

2.4HE和Masson染色结果 NMP组小鼠未见炎性细胞浸润、胆管增生和肝脏胶原沉积，NMP+DDC组肝脏可见大量炎症细胞浸润、胆管增生和肝脏胶原纤维沉积。Torin1+DDC组较DDC组该现象显著减轻。见图3。

图3 各组肝脏组织HE和Masson染色(箭头所指为炎性浸润和胶原沉积，×200)

2.5免疫组织化学法检测各组小鼠肝脏组织胆管增生情况 与NMP组相比，NMP+DDC组CK19、Ki67表达显著增加(P<0.05)；Torin1+DDC组较NMP+DDC组比较肝脏CK19、Ki67的表达显著降低(P<0.05)。见图4、表2。

2.6qRT-PCR结果显示 与NMP组和Torin1组相比，NMP+DDC组IL-6、MCP-1和Arg1 mRNA的表达明显升高，IL-10明显下降，与NMP+DDC组相比，Torin1+DDC组小鼠肝组织中IL-6、MCP-1等促炎细胞因子的表达水平降低，IL-10、Arg1等抑炎因子水平升高，以上结果进一步证实，抑制mTOR信号通路，可以降低 DDC诱导小鼠肝脏炎症，见图4、表2。

图4 免疫组化检测各组肝组织中CK19、Ki67 蛋白表达(箭头所指为表达的CK19和Ki67，×10)

表2 各组小鼠肝脏组织炎性相关基因表达水平比较

3 讨 论

胆汁淤积性胆管损伤是一种由胆汁流动停滞或肝细胞和胆管细胞胆汁分泌转运失败或是由于肝外自由胆汁流动排泄通路受阻所引起的细胞损伤和炎症反应，最终导致胆管增生〔11～13〕。目前已有的治疗胆汁淤积性胆管损伤的药物，主要机制是减轻胆管早期炎症、促进细胞外基质的降解等。但为了进一步提高患者的生活质量、降低病死率，有必要对其发病机制进行更加深入的研究，寻找更有效的抗胆管损伤药物〔14～16〕。

DDC是一种具有肝毒性的化学物质，通过给小鼠喂食含0.1% DDC的饲料3 w，可引起卟啉色素栓塞和胆管增生，伴洋葱皮型导管周围纤维化，小鼠可发展为硬化性胆管炎〔17,18〕。该模型极大地模拟了人类原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)〔19〕的病理变化过程，是研究胆汁淤积性肝纤维化的常用模型。本研究在成功建立DDC诱导胆汁淤积性肝纤维化小鼠模型的基础上，证实mTOR信号在此损伤过程中发挥重要作用。

本实验说明DDC饮食后mTOR信号活化，mTOR抑制剂Torin1的使用可以抑制DDC诱导的mTOR通路活化；Torin1可以在一定程度上减轻DDC饮食小鼠肝脏炎性浸润，胆管增生和胶原沉积程度。以上结果证明：mTOR在DDC诱导的胆管增生、胆管周围炎症形成中发挥着重要的作用，抑制该通路，可以显著缓解以上病理损伤。

CK19不存在于成体肝细胞中而主要存在于肝祖细胞和胆管上皮细胞中，是最广泛使用的胆管细胞和肝祖细胞标记物，也是胆管反应标志物〔20,21〕。Ki67是一种非组蛋白，表达于活跃分裂的细胞核中，是细胞增殖的标志物〔22〕。本研究结果说明Torin1可以减轻DDC 引起的胆管上皮增生，进一步证实mTOR信号在胆管损伤中的重要作用。