TIM-3、STAT3、IL-6在结直肠腺癌中的表达及临床意义

李福青 王红 蒋海涛 杜胜奇 钟江利

(遵义医科大学附属医院消化内科，贵州 遵义 563003)

结直肠癌发病率及患病率呈逐年上升趋势，且患者的发病率呈年轻化，给人类的生命健康带来了极大的威胁，属于危害生命健康的重大疾病。在我国，除肺癌和胃癌之外，结直肠癌的患病率居第3位，伴随饮食结构、生活方式的不同，农村及城市中结直肠癌发病率也不一致，在城市恶性肿瘤中，结直肠癌发病率仅次于肺癌居第二位，在农村地区结直肠癌发病率低于胃癌、肺癌、食管癌、肝癌居第五位〔1，2〕。据相关统计，在全球范围内每年新增加约120万例结直肠癌患者，同时死亡人数每年高达60.9万〔3〕，因此，探索结直肠腺癌的发生发展刻不容缓。白细胞介素(IL)-6、T细胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM)-3、信号转导和转录活化因子(STAT)3是目前在肿瘤发病机制中的研究重点，但在结直肠癌中的具体作用机制仍未明确。本实验通过免疫组化检测在正常结直肠黏膜组织、结直肠腺瘤组织及结直肠腺癌组织中TIM-3、STAT3、IL-6蛋白的表达及与临床病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料 选取2015～2018年在遵义医科大学附属医院胃肠外科行结直肠癌根治术的70例结直肠腺癌患者蜡块标本、42例结直肠腺瘤患者标本、10例正常结直肠黏膜标本(遵从健康人体检自愿从肠镜下取黏膜组织活检患者)，所有标本有完整的病例资料、无放疗、化疗及恶性肿瘤史且行结直肠癌根治术并由病理科医生诊断病理类型。70例结直肠癌标本中男37例、女33例；年龄：≥60岁36例、<60岁34例；部位：结肠32例、直肠38例；肿瘤大小：≥5 cm 41例、<5 cm 29例；浸润深度：T1+T2 25例、T3+T4 45例；分化程度：高分化7例、中分化44例、低分化19例；淋巴结转移：有淋巴结转移48例、无淋巴结转移22例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期22例、Ⅲ+Ⅳ期48例。

1.2主要试剂 兔抗人TIM-3多克隆抗体、兔抗人STAT3多克隆抗体及兔抗人IL-6多克隆抗体均购自美国Abcam公司；多聚-L-赖氨酸、磷酸盐缓冲液(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、二氨基联苯胺(DAB)显色液等均购自上海基因科技有限公司；通用型山羊血清及其他试剂均由遵义医学院附属医院消化内科实验室提供。

1.3实验方法 于遵义医科大学附属医院病理科收集符合纳入条件的蜡块，将蜡块3 μm连续切片，经二甲苯透明试剂Ⅰ、Ⅱ分别10 min脱蜡、浓度梯度100%、95%、80%、70%、50%乙醇分别5 min水化、3%过氧化氢10 min清除内源性过氧化物酶、柠檬酸盐溶液(pH=6.0)抗原修复，冷却后使用山羊血清封闭30 min，滴加一抗(兔抗人IL-6多克隆抗体1∶100，兔抗人TIM-3多克隆抗体1∶150，兔抗人STAT3多克隆抗体1∶200)过夜，第2天取出切片，复温30 min，PBS冲洗3次，每次约10 min，加入适量二抗(兔鼠通用型)30 min，PBS冲洗3次，每次约10 min，DAB显色(显色剂A 1 000 μl：显色剂B 40 μl)，苏木素复染4 min，流水冲洗3 min，盐酸酒精分化10 s，流水冲洗10 min，然后放入浓度梯度50%、70%、85%、95%、100%乙醇中，每次2 min进行脱水，切片风干后盖片显微镜下读取结果。

1.4实验结果判定 首先在100倍物镜下观察标本，排除非特异性染色的区域后，找到阳性细胞着色最强的位置，将物镜调整到400倍，在5个有表达性强的视野下，分别计数细胞的着色强弱(无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)及阳性细胞百分率为阳性细胞数占总细胞数的比值(0分<5%，1分 6%～25%，2分 26%～50%，3分 51%～75%，4分>75%)，两者相乘为0分为阴性，1～4分为弱阳性，5～8分为阳性，9～12分为强阳性。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1各组TIM-3、STAT3、IL-6阳性率比较 TIM-3、 STAT3、IL-6阳性表达主要集中在细胞质，呈黄色、黄棕色或棕色颗粒，在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤及结直肠腺癌组织中TIM-3、STAT3、IL-6均有表达。TIM-3、STAT3、IL-6阳性率比较：结直肠腺癌组>结直肠腺瘤组>正常结直肠黏膜组(均P<0.05)。见表1，图1。

图1 各组TIM-3、STAT3、IL-6表达情况(DAB,×400)

表1 各组TIM-3、STAT3、IL-6阳性率比较〔n(%)〕

2.2TIM-3、STAT3、IL-6与结直肠腺癌患者临床病理特征之间的关系 结直肠腺癌组织TIM-3蛋白的表达情况与肿瘤直径、患者年龄、性别以及肿瘤生长部位均无关(P>0.05)，但与肿瘤的TNM分期、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度和肿瘤的分化程度均相关(P<0.05)，TNMⅢ+Ⅳ期阳性表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴结转移的阳性表达率明显高于无淋巴结转移(χ2=10.329，P<0.05)；肿瘤浸润深度T1+T2阳性表达率明显低于T3+T4组(χ2=4.432，P<0.05)；低分化阳性率明显高于中分化及高分化(χ2=7.638，P<0.05)。STAT3蛋白的表达与肿瘤大小、患者年龄、性别、浸润深度、分化程度及肿瘤生长部位均无关(P>0.05)，但与肿瘤的临床分期、有无淋巴结转移相关(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期阳性率明显高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=12.992，P<0.05)；有淋巴结转移的阳性表达率明显高于无淋巴结转移(χ2=8.767，P<0.05)。IL-6蛋白的表达与肿瘤大小、患者年龄、性别及肿瘤生长部位均无关(P>0.05)，但与肿瘤的临床分期、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度和肿瘤的分化程度均相关(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期阳性表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=17.60，P<0.05)；有淋巴结转移的阳性表达率明显高于无淋巴结转移(χ2=8.839，P<0.05)；肿瘤浸润深度T1+T2阳性表达率明显低于T3+T4组(χ2=4.432，P<0.05)；低分化阳性表达率明显高于中分化及高分化(χ2=12.454，P<0.05)。见表2。

表2 TIM-3、STAT3、IL-6蛋白表达与结直肠腺癌患者临床病理特征之间的关系〔n(%)〕

2.3TIM-3、STAT3、IL-6在结直肠腺癌中表达的相关性 有54例结直肠腺癌标本STAT3和IL-6均阳性，10例IL-6阳性而STAT3阴性，2例STAT3阳性而IL-6阴性。4例IL-6和STAT3均阴性，Spearman相关性分析可知，TIM-3蛋白与STAT3蛋白的表达呈正相关(r=0.357P=0.002)。

3 讨 论

TIM基因家族编码的I膜蛋白即为TIM-3，位于染色体5q33.2〔4〕。在肿瘤微环境中，持续高表达的TIM-3分子的糖基化侧链与其配体半乳凝素9结合后，一方面能促进髓源抑制细胞(CD11b+Gr-1+MDSC和CD4+FoXP3+Treg)的增殖，另一方面特异性地降低转录因子T细胞中表达的T盒即TIM-3和BAT-3结合后导致细胞内片段分离，并将抑制信号传递到细胞内片段，削弱T淋巴细胞的增殖，加速其衰竭并凋亡，从而抑制T细胞介导的免疫应答〔5～7〕。然而在结直肠癌中TIM-3分子远端的N-黏性末端可通过与癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAM)1顺式或反式结合，导致TIM-3与Bat3的结合，从而上调TIM-3表达，削弱了T细胞的免疫反应，从而促进肿瘤细胞增殖〔8〕。Huang等〔9〕通过小鼠直肠癌模型实验证实CEAAM1TIM-3细胞的比例远高于CD4T细胞。同时，CEACAM1可通过调节TIMP-3的表达而诱导T细胞免疫耐受，从而削弱结直肠腺癌患者免疫系统的抗肿瘤能力。在肿瘤患者免疫系统中固有免疫是第一道防线，Chiba等〔10〕研究发现，结直肠腺癌患者的浸润性树突细胞(DC)TIM-3的持续高表达，它与核酸竞争与高迁移率蛋白(HMG)B1结构域A盒竞争，阻碍核酸与HMGB1的结合，因此抗原抗体复合物不能通过Toll样受体(TLR)识别，导致IL受体相关激酶P将被阻断，从而破坏HMGB1介导核酸进入细胞的固有免疫，导致肿瘤细胞凋亡后由核酸释放的免疫原性降低，抑制核酸介导的先天性抗肿瘤免疫反应。同时持续高表达的TIM-3还可通过促使巨噬细胞M2型极化，抑制M1型极化，减弱巨噬细胞吞噬和杀伤效应抑制大肠癌患者肿瘤细胞发生免疫应答，造成大肠癌肿瘤细胞发生免疫逃逸〔11〕。Wang等〔12〕研究发现，通过阻断TIM-3能提高机体固有免疫，从而在一定程度上增加机体的抗肿瘤能力。本实验提示在结直肠腺癌患者中TIM-3持续表达可能存在促进肿瘤发生发展或致癌的作用，且肿瘤的浸润程度越深、分化程度越差、分期越高伴淋巴结转移的结直肠腺癌患者，TIM-3的表达阳性率越高。

STAT是一种细胞质转录因子，由生长因子和细胞因子等肽类配体激活〔13〕。STAT3是STAT家族中的一员，STAT3在白血病、前列腺癌、多发性骨髓瘤、结直肠癌、乳腺癌、肝癌等实体肿瘤及血液组织中持续表达。张国强等〔14〕通过免疫组化实验证明持续高表达的STAT3基因参与结直肠癌的发生与发展，并且与淋巴结转移、分期相关。c-myc基因和细胞周期蛋白(cyclin)D1通过SH2结构域和Src表达上调，抑制结直肠癌细胞凋亡并促进其增殖，促进结肠癌的发生和发展〔15～19〕。研究表明，IL-6作为STAT3的活化因子，通过与配体GP130特异性结合，激活JAK激酶同时磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信号通路被激活，促进结直肠腺癌细胞的增长〔20〕。同时JAK2/STAT3信号通路也可通过生长因子(VEGF)促进肿瘤新生血管生成，导致肿瘤细胞转移。此外STAT3不仅可直接调控VEGF，也可通过HIF-1α的表达间接促进VEGF，进而促进结直肠癌增殖。

IL-6主要由单核细胞、成纤维细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞及多种肿瘤细胞产生，其包括了184个氨基酸，拥有一段疏水信号(其包含28个氨基酸)及两个含有潜在糖基化部分的N端，此外IL-6还拥有C端第4氨基酸邻近区域及N端31-31氨基酸区域的两个活动中心〔21〕。IL-6主要作用为诱导T、B细胞的分化及作用和促进造血功能等，但IL-6亦可抑制免疫系统，刺激肿瘤细胞新生血管的形成，参与了肿瘤的发生与发展。IL-6促使肿瘤发生发展的方式最主要为激活STAT3表达，其通过经典途径即IL-6R直接与配体gp130特异性结合和跨信号转导途径即IL-6在不通过IL-6R与gp130特异性结合的情况下，直接与sIL-6R结合，形成sIL-6R/IL-6复合物，刺激细胞膜上gp130形成同源二聚体，激活JAK激酶同时磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信号通路被激活，表达和转录靶基因，促进结直肠腺癌细胞的增长及新生血管形成，削弱腺癌细胞的凋亡〔22～24〕。张晓芹等〔25〕通过免疫组化表明，结直肠癌细胞中STAT3的表达与IL-6的表达上调，并且呈正相关。