MCP-1、TGF-β1和TLR4蛋白表达与COPD大鼠肺动脉平滑肌细胞功能的关系

马文 杜娟 向凝 杨卉 黄逢敏 冯芳 胡全

(贵州医科大学附属医院 1干部诊疗科，贵州 贵阳 550004；2呼吸与危重症科)

血管重塑是慢性阻塞性肺疾病(COPD)的特征性病理改变，而肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)是血管重塑的主要效应细胞〔1〕。研究发现，PASMCs在各种理化因素刺激下，可合成分泌多种细胞因子，如单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、转化生长因子(TGF)-β1等，在炎症反应、气道重塑等病理过程中发挥重要作用〔2,3〕。在哺乳动物中，Toll样受体(TLR)4参与炎症反应过程，但其信号通路与MCP-1、TGF-β1是否存在相关性尚未阐明〔4～6〕。本研究旨在分析COPD大鼠PASMCs中MCP-1、TGF-β1蛋白的表达情况及与TLR4的相关性，有利于进一步探究COPD的病理机制。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 选取北京大学医学院实验动物中心提供的雄性成年Wistar大鼠36只(合格证号：SCXKG 2015-0020)，SPF级，体重250～300 g，自然光照下常规饲养，室温保持在23℃左右。根据随机数字表法将其分为脂多糖(LPS)组、TLR4抑制剂组、LPS+TLR4抑制剂组和对照组各9只。实验大鼠均健康，LPS组平均体重(232.8±7.7)g，TLR4抑制剂组平均体重(233.6±7.8)g，LPS+TLR4抑制剂组平均体重(233.1±7.6)g，对照组平均体重(232.0±7.5)g，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2实验仪器及试剂 自制有机玻璃舱(92 cm×63 cm×43 cm)；NIB400显微镜(深圳市星明光学仪器有限公司)；蛋白质电泳及转膜仪(上海艾研生物科技有限公司)；Berthold LB 942微孔板式多功能酶标仪(上海艾研生物科技有限公司)；硬包中华牌香烟(上海烟草公司出品)；胎牛血清、LPS、DMEM培养基、TLR4鼠单克隆抗体、β-actin小鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒及总蛋白提取试剂盒(上海抚生实业有限公司)；TAK-242(美国APExBIO公司)。

1.3实验方法

1.3.1建立动物模型 所有实验大鼠饲养1 w适应环境。于实验第1天及第14天时通过气道对LPS组、TLR4抑制剂组和LPS+TLR4抑制剂组大鼠注入LPS(200 μg/次)，而后放入有机玻璃舱中，采用香烟进行熏蒸，1 h/d，共烟熏8 w，舱中保持与大气压力相同，留有小孔与外界相通，内置少量无水氯化钙保持干燥。对照组于第1天及第14天时通过气道注入相同量0.9%NaCl溶液，其余无任何处理，与其余3组大鼠在相同环境中饲养，共8 w。

1.3.2分离培养并鉴定各组大鼠远端原代PASMCs 向大鼠腹腔注射水合氯醛(100 g/L)至麻醉效果满意，取出心肺，用75%乙醇浸泡固定5 min。解剖获得肺动脉3级分支，剥离动脉中膜，在37℃下水浴，加入Ⅰ型胶原酶，20 min后离心去除消化酶，向其加入DMEM高糖培养液后培养(含5% CO2，37℃)。培养第4天时可见细胞萌出，第10天时细胞长至培养瓶90%，选择达到对数生长期的第4～6代细胞进行实验。PASMCs细胞采用免疫组化染色鉴定。

1.3.3Western印迹测定PASMCs中TLR4蛋白水平 LPS组给予LPS(1 ml/L)，TLR4抑制剂组给予TAK-242(1 μmol/L)，LPS+TLR4抑制剂组给予LPS(1 ml/L)+TAK-242(1 μmol/L)，对照组不作任何处理，各组设9个复孔。培养24 h，利用溶液法(RIPA裂解液)提取PASMCs总蛋白，计算上样量并上样。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，时间2 h；转膜，封闭2 h，滴加1∶1 000稀释的TLR4单抗，在4℃环境下过夜，采用TBST洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，每次约10 min；加入1∶5 000的二抗山羊抗鼠IgG，于室温下孵育2 h，发光后通过软件分析图像的灰度值。

1.3.4ELISA检测MCP-1、TGF-β1蛋白水平 细胞的分组、培养基样本量同1.3.3。采用多功能酶标仪在波长595 nm处测量光密度值，制作标准曲线，再根据标本光密度值的相对位置换算MCP-1和TGF-β1蛋白浓度，操作方法严格参照试剂盒说明进行〔7〕。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析、独立样本t检验、Spearman相关性分析。

2 结 果

2.1COPD大鼠模型苏木素-伊红(HE)染色及PASMCs免疫组化染色 对照组肺泡完整，肺组织未见炎细胞浸润；LPS组、TLR4抑制剂组和LPS+TLR4抑制剂组肺泡破裂融成肺大泡，其间伴大量炎性细胞。经ASM-actin免疫组化染色，镜下可见胞液中大部分肌动蛋白形成棕黄色丝状物，平行于细胞长轴。见图1。

图1 各组肺组织HE染色及PASMCs免疫组化染色(×200)

2.2各组PASMCs中TLR4蛋白水平比较 各组TLR4蛋白含量由高到低依次为LPS组(2.92±0.28)、LPS+TLR4抑制剂组(1.90±0.15)、对照组(0.92±0.12)和TLR4抑制剂组(0.63±0.09)，两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图2。

2.3各组细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1蛋白水平比较 4组细胞培养上清液中MCP-1和TGF-β1蛋白水平由高到低依次为LPS组、LPS+TLR4抑制剂组、对照组和TLR4抑制剂组，两组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

1～4：对照组，LPS组，TLR4抑制剂组，LPS+TLR4抑制剂组图2 各组PASMCs中TLR4蛋白的表达

表1 各组MCP-1、TGF-β1蛋白水平比较

2.4TLR4与MCP-1、TGF-β1的相关性 COPD大鼠PASMCs中TLR4蛋白含量与细胞培养上清液中MCP-1和TGF-β1蛋白水平均无相关性(r=0.482，0.363；均P>0.05)。

3 讨 论

目前，医学界公认的COPD发病基础为肺血管和肺实质中的慢性炎症及血管重构，在各种理化因素的刺激下，PASMCs的表型可出现转变，表达炎性因子和多种基质蛋白的能力增强，促使大量炎性细胞积聚，放大炎症级联反应，最终达到促使PASMCs迁移增殖和重塑肺血管的作用〔8～10〕。MCP-1可完成对巨噬细胞的趋化激活作用，从而参与炎症反应〔11〕。TGF-β1是一种可调节细胞分化、生长的活性肽，有调节细胞生长分化的作用〔12〕。在COPD的病理过程中，TGF-β1一方面促进成纤维细胞不断合成，另一方面抑制了细胞外基质的降解，使气道管壁逐渐变厚，最终对患者的肺功能产生不可逆损害〔13〕。研究证实，COPD患者在缓解期和急性加重期MCP-1和TGF-β1均有不同程度的提高〔14〕。研究证实了MCP-1和TGF-β在COPD发病过程中发挥了重要作用〔15〕。TLR4蛋白可在LPS、病原微生物等多种因素刺激下，通过分泌黏附因子、趋化因子和相关细胞因子达到调节炎性反应的效果〔16〕。研究发现，在对细胞采用TAK-242干预后，TLR4的分泌显著下调，但对其他细胞因子的分泌影响较小，因此被认为是TLR4的特异性抑制剂〔17〕。研究发现，通过气道吸入烟雾及注入LPS可导致COPD〔18〕，本研究烟熏并向气道注入LPS的手段制作大鼠COPD模型。

以往研究发现，在MCP-1的表达过程中，TLR4/NF-κB信号通路发挥了重要作用，这一过程是在血管平滑肌细胞中完成的。此外，通过LPS诱导体外培养的PASMCs，TLR4显著表达的同时，MCP-1和TGF-β1的分泌也明显增加〔19〕。研究报道急性加重期COPD患者的组织因子、TGF-β1和MCP-1含量均高于正常人，同时组织因子与TGF-β1、MCP-1呈显著正相关〔20〕。

综上，LPS可上调COPD大鼠PASMCs中TLR4蛋白的表达，并促进MCP-1和TGF-β1的分泌，但TLR4与MCP-1、TGF-β1并无显著相关性。