人诱导多能干细胞移植治疗大鼠心肌梗死

毛庆 梁秀琳 庞毅恒 卢永祥

(广西医科大学第二附属医院 1心内科,广西 南宁 530007；2神经内科)

急性心肌梗死(AMI)是致残和致死的主要心血管疾病之一，其发病率逐年上升〔1〕。特别是心肌梗死面积较大患者的坏死心肌，在修复过程中形成不具有收缩功能的纤维性瘢痕，最终可能导致心律失常、心室功能障碍甚至梗死后充血性心力衰竭〔2〕。虽然心脏有内源性修复系统，但其再生能力有限，不足以完全替代受损心肌组织，心肌损伤几乎不可逆转〔3〕。临床上常用的经皮冠状动脉介入治疗和溶栓治疗虽然可以改善心肌血液供应，但不能产生功能性新生心肌细胞修复坏死心肌组织〔4〕。近年来，向心肌梗死部位注入干细胞，成为增强心肌修复能力、预防或逆转心室重构的新策略〔5〕。

干细胞能够分裂和分化成具有特殊功能的各种成熟细胞类型〔6〕。干细胞分为胚胎干细胞，成体干细胞和多能干细胞〔7〕。体内外实验研究发现，胚胎干细胞和多种来源的成体干细胞被成功诱导分化为有功能的心肌细胞，在植入部位和原有心肌整合，改善了心脏功能〔8～10〕。诱导多能干细胞是近年来从成体干细胞中制备获得的多能干细胞，有着与胚胎干细胞相似的多向分化潜能，可分化为任意类型的细胞，却没有免疫原性和伦理学争议〔11〕。国内外学者关于诱导多能干细胞向心肌细胞分化的体外研究显示其心肌定向分化效率不断提高；移植治疗心肌梗死的体内研究则是将诱导性多能干细胞先在体外诱导分化为心肌细胞再移植至心肌梗死动物模型的心脏内〔12〕。Ishida等〔13〕研究表明，来源于人诱导多能干细胞的心肌细胞移植治疗猪心肌梗死在恢复心脏功能和耗氧量方面优于来源于成体干细胞的心肌细胞。Templin等〔14〕应用计算机断层扫描对移植入大鼠心肌梗死模型中的人诱导多能干细胞在进行跟踪，结果显示在移植后的15 w内细胞的存活、植入和分布达到了预期效果。本研究建立心肌梗死大鼠模型，将人诱导多能干细胞体外诱导分化为心肌细胞进行移植的同时，也将未经诱导分化的人诱导多能干细胞直接移植至心肌损伤部位，比较两种细胞对心肌细胞损伤治疗的效果。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：12周龄SD大鼠，雌性，SPF级，体重(230±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2017-0033。细胞株：人诱导多能干细胞和CardioEasy®人心肌细胞购于北京赛贝生物技术有限公司。

主要仪器和试剂：PSCeasy®人多潜能干细胞培养基、PSCeasy®人多潜能干细胞铺底工作液、CardioEasy®心肌复苏培养基、CardioEasy®人心肌细胞维持培养基、CaridoEasy®人心肌细胞消化液、PSCeasy®人多潜能干细胞消化液和PSCeasy®人多潜能干细胞复苏培养基购于北京赛贝生物技术有限公司；CM-DiI 活细胞染色剂购于美国Invitrogen公司；Masson三色染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；水合氯醛和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购于Sigma公司；兔抗大鼠CD31多克隆抗体、羊抗鼠IgG3-FITC购于美国Santa Cruz公司；CO2培养箱、超净工作台购于美国Thermo公司；光学显微镜和荧光显微镜购于德国Leica公司。

1.2实验方法

1.2.1SD大鼠心肌梗死模型的制备〔15〕40只SD大鼠禁食12 h，用氯胺酮(75 mg/kg体重)腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位，气管插管连接呼吸机辅助通气，常规备皮、消毒、铺巾，自大鼠左胸第四肋间做横切口打开胸腔，推开左肺，撕开心包膜，充分暴露左冠状动脉，自左心耳下方2 cm处进针，用8-0缝合线缝扎冠状动脉左前降支，待结扎下方心肌大面积变白和室壁运动减弱，胸前放置引流软管，逐层缝合关胸。造模成功的标志〔16〕：造模72 h后进行以下检查，①心电图结果显示ST段抬高，Q波宽而深，T波倒置；②心脏彩超结果显示左室射血分数和左室缩短分数降低。 造模过程中2只大鼠死亡，2只大鼠未达到造模成功标准，其余36只大鼠造模成功。另取12只SD大鼠只开胸、不结扎冠状动脉作为假手术组。

1.2.2细胞培养〔17〕已经鉴定的人诱导多能干细胞用人多潜能干细胞复苏培养基复苏，用人多潜能干细胞铺底工作液涂在培养皿底部，将人诱导多能干细胞接种于培养皿内，用人多潜能干细胞培养基在37℃、5%CO2培养箱内培养，隔日换液1次，待细胞生长融合达培养皿底部85%后用人多潜能干细胞消化液消化细胞进行传代；用心肌复苏培养基复苏已经鉴定的人心肌细胞，将人心肌细胞接种于培养皿中用人心肌细胞维持培养基在37℃、5%CO2培养箱内培养，每日换液1次，待细胞生长融合达培养皿底部85%后用人心肌细胞消化液消化细胞进行传代。将传至第3代的人诱导多能干细胞和人心肌细胞用移植。

1.2.3实验分组与细胞移植 将造模成功的36只SD大鼠随机分为模型组、心肌细胞组和干细胞组，每组12只。①模型组：不予治疗；②心肌细胞组：用第3代人心肌细胞移植；③干细胞组：用第3代的人诱导多能干细胞移植；④另取12只作为假手术组：不予治疗。细胞移植方法：在移植前24 h，用CM-DiI 活细胞染色剂分别标记人诱导多能干细胞和心肌细胞，PBS洗涤细胞，用PBS将人诱导多能干细胞和心肌细胞制成浓度为1×106/ml的细胞悬液，每只大鼠经颈静脉注射200 μl细胞悬液。

1.2.4冰冻切片观察人诱导多能干细胞和心肌细胞的归巢〔18〕移植2 w后，各组随机选取3只大鼠，麻醉后快速取出心脏，切除结扎点水平以上的心房和部分心室，将剩余部分放入-80℃冰箱，快速冷冻30 min，用冰冻切片机连续切片，制成厚度为制作8 μm的冰冻切片，4%多聚甲醛固定1 h，DAPI染核5 min，放淬灭封片剂封片，荧光显微镜下用560 nm波长激光器激发绿色荧光、用405 nm波长激光器激发蓝色荧光，观察CM-DiI标记的呈绿色荧光的人诱导多能干细胞和人心肌细胞在心肌梗死部位的归巢情况。每张切片选取有绿色荧光的5个低倍视野，用Image Pro6.0软件测量视野中呈绿色荧光细胞的个数，计算平均值比较细胞归巢情况。

1.2.5免疫荧光染色检测细胞定植部位血管新生情况〔19〕移植4 w后，各组随机选取3只大鼠，麻醉后快速取出心脏，切除结扎点水平以上的心房和部分心室，将剩余部分心肌放入4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水和透明后常规石蜡包埋，石蜡切片机连续切片。将制成的石蜡切片，PBS漂洗、烤片、脱蜡、水合，用10%山羊血清室温封闭1 h，滴加兔抗大鼠CD31多克隆抗体(工作浓度1∶50)，4℃避光孵育12 h，次日去除抗体溶液，滴加羊抗鼠IgG3-FITC避光孵育45 min，抗淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察。CD31阳性血管内皮细胞发红色荧光，为了不影响CD31阳性细胞观察未用DAPI染核。每张切片选取有红色荧光的5个低倍视野，用Image Pro6.0软件测量视野中呈红色荧光细胞的平均光密度值，计算平均值比较血管新生情况。

1.2.6Masson染色观察心肌纤维化情况〔20〕移植4 w后，取1.2.5中制作的石蜡切片，脱蜡、梯度乙醇水合、流水冲洗，1%地伊红染液染色1 h，蒸馏水冲洗2 min，苏木素染色5 min，蒸馏水冲洗2 min，丽春红染液染色10 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，1%磷酸铝溶液分化1 min，2%亮绿染液染色1 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察：胶原纤维被染成蓝色、心肌纤维染成粉红色。用Image Pro6.0软件测量切片横截面中心肌纤维化面积和心肌梗死面积，根据公式：心肌纤维化面积百分比(%)=心肌纤维化面积/心肌梗死面积×100%。

1.2.7心脏超声检测心功能变化情况〔22〕各组随机选取3只大鼠，在移植4 w后，用心脏超声诊断仪检测各组大鼠心功能各项参数：左室收缩末期内径、左室舒张末期内径和左室射血分数，连续检测5个心动周期，取平均值进行比较。

1.3观察指标 ①移植细胞归巢情况；②血管再生情况；③心肌纤维化情况；④心功能各项指标。

1.4统计学分析 采用SPSS20.0软件进行方差分析，LSD检验，t检验。

2 结 果

2.1各组移植细胞的归巢情况比较 假手术组和模型组心肌梗死区域和非梗死区域未见绿色荧光，心肌细胞组和干细胞组心肌梗死区域可见点状绿色荧光散在分布，见图1，心肌细胞组归巢细胞数量高于干细胞组(62.21个 vs 46.32个，P<0.05)。

图1 各组心肌细胞冰冻切片的荧光显微镜观察结果(×400)

2.2各组血管再生情况比较 假手术组心肌纤维间可见大量呈红色荧光的CD31阳性内皮细胞聚集成血管轮廓，模型组在梗死区域偶见红色荧光的CD31阳性内皮细胞，心肌细胞组在梗死区域可见呈红色荧光的CD31阳性内皮细胞散在分布，干细胞组在梗死区域可见较多呈红色荧光的CD31阳性内皮细胞成团分布，见图2。假手术组CD31阳性细胞的平均光密度值(0.096)明显高于模型组、心肌细胞组和干细胞组(0.026、0.029、0.061，P<0.01)；干细胞组CD31阳性细胞的平均光密度值明显高于模型组和心肌细胞组(P<0.01)；心肌细胞组CD31阳性细胞的平均光密度值高于模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组血管再生免疫荧光染色结果(×400)

2.3各组心功能比较 移植4 w后，模型组、心肌细胞组、干细胞组左室收缩末期内径和左室舒张末期内径明显高于假手术组，而左室射血分数明显低于假手术组(P<0.05)；心肌细胞组、干细胞组左室收缩末期内径和左室舒张末期内径明显低于模型组，而左室射血分数明显高于模型组(P<0.05)；干细胞组左室收缩末期内径和左室舒张末期内径明显低于心肌细胞组，而左室射血分数明显高于心肌细胞组(P<0.05)。见表1。

表1 各组心功能比较

2.4各组心肌纤维化情况比较 见图3。假手术组心肌组织结构正常，排列整齐的心肌细胞被染成红色，未见心肌组织纤维化；模型组心肌梗死区域可见大量蓝色胶原纤维取代了正常心肌结构；心肌细胞组心肌梗死区域可见大量蓝色胶原纤维填充；干细胞组心肌梗死区域可见蓝色胶原纤维散在分布；干细胞组心肌纤维化面积(30.6%)明显小于模型组和心肌细胞组(52.3%、41.2%，P<0.01)。

图3 各组心肌纤维化Masson染色结果(×400)

3 讨 论

诱导多能干细胞和间充质干细胞均来源于自体细胞，但诱导多能干细胞的分化效率高于间充质干细胞，为心肌梗死的细胞移植等再生医学提供了理想的种子细胞〔13，21〕。Ye 等〔22〕在体外将人源诱导多能干细胞诱导分化为心肌细胞后注射移植入心肌梗死猪模型心肌梗死边缘区域，结果显示移植的心肌细胞整合到了原有的心肌组织中，缩小了心肌梗死的面积，改善了心室功能。Zhang等〔23〕将人心肌成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞并诱导分化为心肌细胞移植到心肌梗死模型小鼠心肌梗死区域4 w后，心肌梗死区域凋亡细胞减少，左室心肌收缩力增强。以上研究表明，人诱导多能干细胞来源的心肌细胞直接注射到动物模型心肌梗死边缘能促进心肌损伤后的修复。但诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率一直制约其应用〔24，25〕。祝因苏等〔26〕直接将诱导多能干细胞注射移植到心肌梗死模型猪的心肌梗死损伤部位，缩小了梗死面积并改善了心肌收缩功能，结果说明直接移植诱导多能干细胞同样能减轻心肌损伤，促进心肌功能的好转，未见明显的免疫排斥反应。以上研究都是通过干细胞心内原位移植，模型动物需要接受开胸手术，较静脉移植的损伤大。本研究结果表明人诱导多能干细胞可归巢到心肌梗死边缘区域，缩小了心肌梗死面积，改善了左室心肌功能。同时，本研究结果显示，心肌功能和纤维化改善方面心肌细胞治疗优于人诱导多能干细胞治疗，在血管再生方面人诱导多能干细胞优于心肌细胞。

研究发现，通过静脉移植干细胞修复心肌损伤的过程中，干细胞不仅要经血液定向迁移归巢到心脏部位，还需要黏附于心肌组织内的毛细血管内皮细胞，通过变形运动穿过内皮间隙直接与损伤心肌组织接触〔27，28〕。CM-DiI荧光染料与细胞膜中的磷脂结合来标记细胞，发出的红色荧光强而稳定，存在时间长〔29〕。结果显示，两种细胞均归巢到心肌梗死损伤部位，人诱导多能干细胞主要分布在梗死区域边缘，心肌细胞则出现在损伤心肌组织内；从数量上比较发现心肌细胞归巢数量高于人诱导多能干细胞，其可能原因是心肌细胞与心肌组织的相容性优于人诱导多能干细胞，心肌细胞更容易定向迁移到心肌损伤部位发挥作用。Yu等〔30〕和Pinho-Ribeiro等〔31〕研究均证实经静脉移植间充质干细胞治疗心肌梗死时仅有约2%的干细胞归巢，最后只1%的干细胞定植。既往研究表明，干细胞移植治疗心肌梗死的主要机制是通过旁分泌作用促进血管新生和抑制心肌纤维化，而心肌细胞再生作用较小〔32～34〕。本研究提示人诱导多能干细胞可能通过旁分泌作用促进组织中血管的再生；心肌细胞组血管再生情况与模型组没有明显差异的可能原因是心肌细胞不具有旁分泌功能。本研究提示人诱导多能干细胞可能通过抑制心肌纤维化减小心肌梗死面积。以上结果与赵启明等〔35〕的荟萃研究一致，干细胞通过旁分泌多种细胞因子促进血管新生和增加血管密度，改善损伤局部的微环境，抑制胶原纤维形成，改善心肌的组织结构和提高心肌收缩能力。本研究结果与上述研究结果一致。