奶豆腐中乳酸菌的分离鉴定及风味特性研究

洋洋，乌有娜，双全，王玉荣，郭壮

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018；2.湖北文理学院食品科学技术学院，湖北襄阳441053）

0 引言

内蒙古传统奶豆腐是蒙古族、哈萨克族等少数民族喜欢食用的一种传统乳制品，蒙语可称为“Hurood”[1-2]，奶豆腐是以羊奶或者是牛奶中本身的环境中的微生物自然发酵而形成的[3]。当然在制作传统奶豆腐中乳酸菌时候发挥着至关重要的作用[4]。另外奶豆腐的营养价值较高，但人们对于传统乳制品的消费是甚少[5]，主要原因是奶豆腐的感官品质[6]较差。研究发现，奶豆腐中的微生物主要包括乳酸菌[7-9]、霉菌[10-11]、酵母菌[12]等3大类群，其中乳酸菌对传统奶豆腐感官品质的改善发挥着重要的作用[13-15]。

本研究从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗采集奶豆腐样品，对其中的乳酸菌进行分离鉴定，采用电子鼻和电子舌对食品的风味和滋味进行评价，以期为后续的传统奶豆腐的相关产业化生产提供支持。

1 材料与方法

1.1 样品来源

本实验采集的样品来自于内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗长虹乳制品厂，研究人员于2019年3月，在内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗长虹乳制品厂、正蓝旗各个奶食店等地区采集。将采集的样品立即放置在低温保存，及时带回实验室进行乳酸菌的分离纯化等研究。

1.2 培养基与试剂

培养基：MRS固体培养基和MRS液体培养基，MRS固体培养基和MRS液体培养基均由国药集团化学试剂有限公司所提供。

试剂：提取DNA所用试剂，PCR扩增和电泳检测所用试剂，细菌基因组DNA试剂，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

1.3 仪器与设备

DYY-12水平电泳仪，北京市六一仪器厂；DCodeTMSystem、UV PCDS8000凝胶成像分析系统，美国BIO-RED公司；VeritiTM 96孔梯度PCR扩增仪，美国AB公司；SA402B电子舌，武汉高科南新贸易有限公司；PEN 3电子鼻，德国Airsense公司。

1.4 乳酸菌的分离纯化及保存

奶豆腐、酸马奶等样品中的乳酸菌计数方法是采用涂布培养法。奶豆腐样品使用刀具切成粉末，称取1 g到15 mL无菌石蕊牛乳中，37℃培养24 h，再用涂布平板法对样品进行稀释涂布，37℃培养48 h，获得样品中的不同菌落，观察并记录菌落形态（颜色、大小、形态等），挑取不同的特征菌落，于对应的固体培养基上划线2～3次，直至获得纯培养物。经革兰氏染色，过氧化氢酶实验，将疑似乳酸菌的纯培养物在30%甘油里保藏，以待后续实验。

1.5 DNA的提取及纯度的检测

采用CTAB法提取分离菌株的基因组DNA[16]，按照MVEOBIANG-A[17]等方法提取乳酸菌总DNA在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上跑胶检测。

表1 PCR反应体系[18]（25μL）及扩增程序

扩增完成之后，将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测到，如在1 500 bp处有明亮条带且无拖尾现象、即PCR扩增成功，再使用PCR清洁试剂盒对PCR产物进行纯化，PCR产物连接到pMD18-T载体后，进行克隆并送由武汉呢天一辉远生物科技有限公司进行测序。

1.6 同源性分析

将测序得到的16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank数据库进行BLAST对比，根据各个菌株的序列同源性选取相似度较高的模式菌株，再使用Mega5.0的邻接法构建系统发育树，再进行所分离菌株的系统发育关系。

1.7 奶豆腐的滋味和风味品质评价

1.7.1 奶豆腐滋味品质的评价

将奶豆腐切成粉末称取30 g放入样品瓶中，加等体积的纯水稀释5倍，3 000 g离心10 min，去上清夜待用。将上清夜放入样品瓶后按照王玉荣等方法[19]使用SA402B电子舌对其鲜味、苦味、酸味、苦味和咸味及后味A（涩的回味）、后味（苦的回味）和丰度（鲜的回味）进行测定。

1.7.2 奶豆腐风味品质的评价

将奶豆腐样品进行预处理后，10 g放入样品瓶中置于40℃恒温水浴锅中加热30 min，参照杨成聪[20]的方法，使用PEN 3电子鼻对其风味进行评价，其中测试时间为60 s，然后取49、50、51的数据再进行分析。

1.8 数据分析

本实验使用主成分分析对奶豆腐的滋味整体结构的差异性分析，使用MAGA5.0构建系统发育树，使用Origin2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的分离鉴定

2.1.1 乳酸菌分离菌株的菌落形态及表型特征

根据乳酸菌的形态学特征，初步从8份样品中共分离出33株疑似乳酸菌的菌株。在MRS固体培养基上菌株的菌落呈现中等大小不一，乳白色、边缘整齐，有一些菌落的表面光滑，而有些粗糙，如图1。经革兰氏染色实验以及过氧化氢酶实验反应，即为革兰氏阳性菌和过氧化氢酶阴性菌。将33株菌初步定为乳酸菌。

图1 部分菌株固体培养基菌落形态

2.1.2 系统发育树的构建和乳酸菌鉴定结果

由图2可以看出，NDF4-3、4-5、4-5、4-10、5-1、5-5、5-6、6-1、6-2、6-3、6-5、6-8菌株与Lactobacillus delbrueckii聚为一类群，且从表2可以看出来同源性为99%，故将其鉴定为Lactobacillus delbrueckii。NDF5-2、6-4、6-6、6-7、7-3菌株与Lactobacillus fermentum聚为一类群，且同源性为99%，因此可以鉴定为Lactobacillus fermentum。NDF2-1、2-3与Enterococcus faecium聚为一类群，且同源性为99%，因此归为Enterococcus faecium。而NDF3-1、7-1、7-2、8-1菌株与Pediococcus acidilactici聚为一类群，并且同源性为99%，所以可鉴定为Pediococcus acidilactici。NDF1-1、1-3、1-5、1-6、2-2、2-4、2-5、3-4、3-5菌株与Lactococcuslactis聚为一类群，并同源性为99%，因此鉴定Lactococcus lactis。然而NDF8-3菌株与Lactococcus garvieae聚为一类，且同源性为99%，因此可以鉴定为Lactococcusgarvieae。

图2 基于奶豆腐中乳酸菌16SrDNA基因的系统发育树

表2 NDF1-NDF8分离菌株16SrDNA基因序列比对结果

2.2 奶豆腐滋味和风味品质的评价

奶豆腐各滋味指标相对强度的箱型图如图3所示。由图3可知，奶豆腐的滋味品质之间是存在较大的差异，其酸味、苦味、涩味、咸味、鲜味及后味A（涩的回味）和后味B(苦味的回味)的极差值是都超过1，其中奶豆腐的苦味的组内差异是最大的。基于传统电子鼻技术，奶豆腐的风味指标的强度如表3所示。

图3 奶豆腐不同滋味的箱型图

由表3可知，所有奶豆腐的各风味指标之间存在着较大的差异，响应值存在比较差异较大的传感器为W 1S、W 5S、W 1W，其说明奶豆腐的挥发性风味物质的主要差异是在氢氧化物和甲烷以及有机硫化物、萜类物质上。)

表3 化学传感器及其对应的敏感物质类型

3 结论

从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗采集了8份奶豆腐样品，通过传统的培养方法，共分离到了33株乳酸菌。对这些乳酸菌进行了鉴定，结果显示它们分别属于德式乳杆菌、发酵乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌、戊糖片球菌、瑞士乳杆菌等6个菌种，归为乳杆菌，肠球菌和片球菌3个乳酸菌属。且奶豆腐样品的挥发性风味物质的主要差异是显示在氢氧化合物、甲烷以及有机硫化物和萜类物质上是有较大的差异，而奶豆腐中的苦味组内差异是相对于其它滋味是较大的。