一株鼠李糖乳杆菌培养条件的优化

余萍，张春宇，矫艳平，闵祥博，赵迪，李丽娜

（汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，沈阳110000）

0 引言

益生菌是一类有益于宿主健康的活性微生物，具有改善宿主肠道的微生态平衡、增强免疫力及缓解乳糖不耐受等生理功能[1-3]。被广泛应用的益生菌有乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌等[4]。鼠李糖乳杆菌是近年来研究和应用最为广泛的益生菌，属异型发酵的无芽孢短杆菌，在显微镜下观察到的鼠李糖乳杆菌常以单链状或成链状存在，具有调节机体免疫、改善脂质代谢等功能[5-9]。

乳酸菌培养基中除需碳源、氮源、维生素及矿物质等营养元素外，还需加入具有促生长作用的物质，即促生长因子。为达到鼠李糖乳杆菌HCS01-003的增殖培养，本研究不仅优化了培养条件，还筛选了优化培养基中的促生长因子，包括低聚异麦芽糖、水苏糖、低聚半乳糖及维生素B2、维生素B5、维生素B12。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

鼠李糖乳杆菌HCS01-003，筛选自6个月大顺产健康婴儿粪便，汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司提供。

1.1.2 培养基

基础培养基：蛋白胨8.0 g/L、葡萄糖25.0 g/L、酵母浸出物3.0 g/L、乙酸钠6.0 g/L、硫酸镁0.5 g/L、吐温80 0.5 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、余量为纯化水，pH值6.20，按照配方比例称量各组分、混合，加热溶解，用1 mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.20，115℃下灭菌30 min。

优化培养基：蛋白胨14.0 g/L、葡萄糖30.0 g/L、酵母浸出物6.0 g/L、乙酸钠3.0 g/L、硫酸镁0.10 g/L、吐温80 0.5 g/L、低聚异麦芽糖1 g/L、水苏糖1.5 g/L、低聚半乳糖2 g/L、磷酸二氢钾3.0 g/L、余量为无菌水，pH值6.80；按照配方比例称量各组分，混合，加热溶解，用1 mol/L食品级NaOH溶液调培养基pH值至6.80，115℃下灭菌30 min。

1.1.3 促生长因子

低聚异麦芽糖，保龄宝生物股份有限公司；低聚半乳糖，量子高科（中国）生物股份有限公司；水苏糖，承德京天食品科技有限公司；维生素B2，湖北广济药业股份有限公司；维生素B5，新发药业有限公司；维生素B12，宁夏金维制药股份有限公司。

1.1.4 实验仪器设备

SW-CJ-2D双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；DHP-360/420电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；721型可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；三目系列生物显微镜，江西江凤光学仪器有限公司；DZKW-S-8电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种保存

挑取单菌落，接种于5 mL基础培养基中，37℃静置培养20 h后，5%接种量转接于100 mL基础培养基中，37℃静置培养16 h。将菌悬液离心后取菌泥，以10∶1的比例加入基础培养基和甘油混合液（基础培养基∶50%甘油=2∶3），分装于冻存管中，-80℃冷冻保存。

1.2.2 菌株生长曲线的测定

将冻存管保存的菌种转接到10 mL基础培养基中，37℃静置培养17 h，获得菌悬液。以5%的接种量转接50 mL基础培养基中，培养0～24 h，每小时取出一瓶测定菌悬液的OD值和pH值，绘制生长曲线。

1.2.3 菌株培养条件的优化

（1）菌种复苏。将冻存管放入37℃水浴锅内进行菌种复苏，15～30 s，至冻存管内液体全部融化。

（2）一级培养。将冻存管内的菌体转接到10 mL基础培养基中，一定温度下培养16 h，获得菌悬液。

（3）二级培养。将一级培养的菌悬液转接到100 mL基础培养基中，上述相同温度培养16 h，测定菌悬液的pH值、吸光度和收率，考察培养温度、培养基初始pH值、接种量和需氧型对菌体生长的影响。

（4）三级培养。在较优的培养温度、初始pH值和需氧型和接种量条件下，将二级培养的菌悬液接种到300 mL优化培养基中，静置培养16 h，测定菌悬液的收率和活菌数，验证培养条件。考察因素如表1所示。

表1 培养条件因素水平

1.2.4 优化培养基促生长因子的筛选

（1）单因素筛选。向优化培养基中分别添加1.0 g/L的低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖、维生素B2、维生素B5、维生素B12，115℃灭菌30 min。采用相同的培养条件分别进行三级发酵培养鼠李糖乳杆菌，培养结束后，取菌悬液采用平板计数法检测活菌数。

（2）促生长因子添加量筛选实验。将单因素实验筛选的活菌数较高的促生长因子分别以0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g/L的质量浓度添加到优化培养基中，115℃灭菌30 min。采用相同的培养条件分别进行三级发酵培养鼠李糖乳杆菌，培养结束后，取菌悬液采用平板计数法检测活菌数，考察促生长因子添加量对菌体生长的影响。

（3）正交实验。设计正交实验，将筛选出的促生长因子按照不同的添加量混合添加到基础培养基中，115℃灭菌30 min，采用相同的培养方法分别培养鼠李糖乳杆菌，培养结束后，取菌悬液采用平板计数法检测活菌数，考察作用较强的促生长因子复合添加对菌种培养的促生长作用。

2 结果

2.1 菌株生长曲线测定结果

如图1所示，培养基pH值随着鼠李糖乳杆菌的生长逐渐降低，是由于菌体在其生长代谢过程中产生了大量的乳酸[10]。菌体培养时间越长，培养基中积累的乳酸越多，导致菌体周围环境pH值越低，从而干扰菌体正常代谢，抑制其生长繁殖[11-12]。OD值结果发现0～1 h，鼠李糖乳杆菌细胞的分裂繁殖及生长缓慢，处于延滞期；1～16 h菌体生长速率最快，代时最短，进入生长对数期；17～24 h，随着营养物质的消耗，乳酸含量升高，环境pH值下降，OD值上升趋势逐渐平缓，说明此时为菌体生长的稳定期。根据鼠李糖乳杆菌HCS01-003菌株生长规律及生产要求等因素，确定自然发酵培养时间定为（16±0.5）h。

图1 鼠李糖乳杆菌HCS01-003二级培养生长曲线

2.2 菌株培养条件优化结果

2.2.1 培养温度对菌体生长的影响

固定接种量为4%，初始pH值为6.60，静置培养，分别考察不同培养温度33、35、37、39、41℃条件下菌体吸光度和收率。每个条件重复3次实验，取平均值。培养温度直接对细胞中的酶、蛋白质、DNA等大分子的合成与活性产生一定的影响，培养温度较最适温度高或低，生长速率都会随之下降[13－14]。由表2及图2可知，鼠李糖乳杆菌HCS01-003的生长随温度升高呈上升趋势，当培养温度为37℃时，测定的OD值及收率均最高，随后随温度的升高呈下降趋势。故鼠李糖乳杆菌HCS01-003最佳培养温度为37℃。

表2 培养温度对菌体生长的影响

图2 培养温度对菌体生长的影响

2.2.2 初始pH值对菌体生长的影响

初始pH值对乳酸菌生长具有一定的影响，过低会使培养基过早酸化，过高则会碱化培养基，均会抑制乳酸菌的生长[15]。固定培养温度为37℃，接种量为4%，静置培养，分别考察初始pH值为6.40，6.60，6.80，7.00，7.20条件下菌悬液吸光度和菌泥收率。结果见表3及图3，鼠李糖乳杆菌HCS01-003适合弱酸环境下生长，当初始pH值为6.80时，OD值较高，收率明显高于其他组，为最佳适初始pH值。

图3 培养基初始pH值对菌体生长的影响

表3 初始pH值对菌体生长的影响

2.2.3 需氧型对菌体生长的影响

固定培养温度为37℃，接种量为4%，初始pH值为6.80，分别测定静置培养和振荡培养两种培养方式菌悬液吸光度、菌泥收率。表4实验结果表明，鼠李糖乳杆菌HCS01-003更适静置培养。

表4 需氧型对菌体生长的影响

2.2.4 接种量对菌体生长的影响

不同接种量对菌体的生长存在一定的而影响，过低使菌体生长缓慢，发酵周期长，过高的接种量又会导致前期生长快，营养成分不足而提前死亡[15]。固定培养温度为37℃，初始pH值为6.80，静置培养，分别考察接种量4%、5%、6%条件下菌悬液的OD值和收率，优化接种量。根据表5及图4实验结果，随着接种量的增加，OD值和菌泥收率均增加，当接种量5%时，菌泥收率可达到1.386%。考虑实际生产需要及成本等因素，采用接种量5%为优化后接种量。

表5 接种量对菌体生长的影响

图4 接种量对菌体生长的影响

2.2.5 培养条件验证结果

将经过优化后培养条件（培养温度37℃，初始pH值为6.80，5%接种量、静置培养）下的二级培养菌悬液，以相同条件接种到300 mL优化培养基中，静置培养16 h，测定菌悬液的pH值、收率和活菌数，重复操作实验3次取平均值，验证培养条件。验证后所得结果为活菌数2.97×109mL-1，菌泥收率1.593。

2.3 优化培养基促生长因子筛选结果

2.3.1 促生长因子单因素筛选结果

低聚异麦芽糖在动物肠道内虽无法被机体消化酶和有害菌如产气荚膜杆菌分解利用，但却是乳酸菌、双歧杆菌等有益微生物定植和生长的良好培养基[16]。体外研究实验证明低聚半乳糖及水苏糖等低聚糖对乳酸菌具有明显的增殖作用[17]，而维生素为乳酸菌生长提供营养。根据表6和图5可知，添加了促生长因子后，鼠李糖乳杆菌经三级培养后的菌悬液活菌数与空白对照相比明显增多，其中添加低聚异麦芽糖的为最多，其次是水苏糖和低聚半乳糖，维生素B5、维生素B12、维生素B2促生长效果不明显，这表明所选的促生长因子对该鼠李糖乳杆菌的生长均有一定的促进作用，其中促生长作用较显著的为低聚异麦芽糖、水苏糖、低聚半乳糖。

表6 单因素筛选菌悬液活菌数

图5 单因素筛选菌悬液活菌数对比结果

2.3.2 促生长因子添加量筛选实验结果

2.3.2.1 低聚异麦芽糖添加量对菌体生长的影响。

根据图6所示，随着低聚异麦芽糖添加量的增加，菌悬液活菌数先增加后减少。当低聚异麦芽糖添加量在1～2 g/L时，菌体活菌数较高，故选用1 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L作为低聚异麦芽糖的实验水平。

图6 低聚异麦芽糖添加量对菌体生长的影响

2.3.2.2 水苏糖添加量对菌体生长的影响。

由图7可知，菌体活菌数随着水苏糖添加量的增加而加大，当添加量为2.0 g/L时，活菌数则保持平稳状态，所以选用1.5、2.0、2.5 g/L作为水苏糖的实验水平来考察水苏糖的最适添加量。

图7 水苏糖添加量对菌体生长的影响

2.3.2.3 低聚半乳糖添加量对菌体生长的影响。

由图8可知，当低聚半乳糖添加量为2 g/L时，活菌数最高，其次是2.5 g/L和1.5 g/L，故选用1.5、2.0、2.5 g/L作为低聚半乳糖的实验水平来考察水苏糖的最适添加量。

图8 低聚半乳糖添加量对菌体生长的影响

2.3.3 正交实验结果

由表8所示，根据R值可知，在培养基中复合添加三个促生长因子时对鼠李糖乳杆菌的促生作用顺序为A＞C＞B，即低聚异麦芽糖＞低聚半乳糖＞水苏糖。由k值可知，A1B1C2为最优组合，即低聚异麦芽糖1 g/L，水苏糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L。2.3.4验证实验

表7 正交实验因素水平表

表8 正交实验结果与分析

将正交实验结果中的最优组合，即低聚异麦芽糖1 g/L，水苏糖1.5 g/L，低聚半乳糖2 g/L（均为质量浓度）添加到优化培养基中，采用上述相同的方法培养鼠李糖乳杆菌，培养结束后，取菌悬液检测活菌数，检测结果为7.8×109mL-1，活菌数最高。根据单因素实验结果及正交实验结果，活菌数仅次于最优组合的是仅添加低聚异麦芽糖1.5 g/L和正交实验1组，结果均为7.7×109mL-1，均符合生产要求，考虑到生产成本，选择促生长因子方案为低聚异麦芽糖1.5 g/L。

3 讨论

鼠李糖乳杆菌是应用最广泛的益生菌，能够抗氧化、增强机体免疫力等[18]。然而发挥益生作用不仅需要代谢产物，菌体活性也十分关键，培养温度、接种量及初始pH值等培养条件对乳酸菌素产量均有直接或间接影响[19-20]。本研究中培养温度、培养基初始pH值及接种量等，随着培养条件的改变，菌体的生长均会随之呈上升或下降趋势，与菌体生长特性有关。促生长因子的作用根据图5可知，与空白对照相比，低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖、维生素B2、维生素B5、维生素B12对鼠李糖乳杆菌的培养都有促生长作用，而低聚异麦芽糖和水苏糖的促生长作用较大，可能是因为低聚异麦芽糖和水苏糖都具有α-1，6糖苷键功能键，且聚合度都较低有关。

4 结论

通过单因素实验优化了鼠李糖乳杆菌HCS01-003培养条件，以菌悬液OD、菌泥收率及活菌数为考察指标，研究了培养温度、培养基初始pH值、需氧型及接种量对菌体生长的影响，以优化最佳培养条件。选取了6种对鼠李糖乳杆菌生长有促进作用的促生长因子，添加到优化培养基中，根据菌株在培养基上的菌落生长情况来研究6种促生长因子对鼠李糖乳杆菌生长的促进作用，并从中筛选出最佳的促生长因子及复合添加的最优组合。

培养条件优化结果最适培养温度为37℃、培养基初始pH值为6.8、接种量5%、静置培养。通过单因素筛选实验，确定了6种促生长因子对该鼠李糖乳杆菌的促生长作用依次为低聚异麦糖、水苏糖，低聚半乳糖、维生素B5、维生素B12、维生素B2。选取了促生长作用较显著的低聚异麦芽糖、水苏糖，低聚半乳糖进行正交实验，筛选了复合添加的最优组合，考虑到生产成本因素，确定促生长因子方案为添加低聚异麦芽糖1.5 g/L。经最适培养条件及添加优选促生长因子的优化培养基培养的鼠李糖乳杆菌HCS01-003菌悬液活菌数可达7.7×109cfu/mL。