牛乳中α-乳白蛋白的分离纯化工艺研究

刁梦雪，颜蜜，陈思如，杨婉露，宋一帆，银雪，张铁华

（吉林大学食品科学与工程学院，长春130062）

0 引言

α-乳白蛋白是乳清中分子量最小的乳蛋白，含量约为1.2 g/L[1-2]。α-乳白蛋白富含色氨酸[3]，其在婴幼儿的生长发育过程中起重要作用，它可以提升婴幼儿的睡眠质量[4]、改善情绪以及提高食欲。同时，α-乳白蛋白更容易被婴幼儿的胃肠道吸收，蛋白质被消化降解产生的抗菌肽，可以参与调节肠道菌群的平衡[5]。

α-乳白蛋白是人乳中含量最多的功能蛋白[6]。据报道，来自牛源与人源中的α-乳白蛋白有74%的氨基酸相同[7]，在功能和结构上二者较为相近。因此，提升婴幼儿配方奶粉中α-乳白蛋白的含量，可以使之更接近母乳的组成[8-10]，在婴幼儿的生长发育阶段中满足营养需求[11]。

常见的α-乳白蛋白的分离纯化技术有盐析法[12]、等电点沉淀法[13]、选择性热聚合法[14-15]、双水相萃取法[16]、膜分离法[17]及色谱纯化法[18-19]等。盐析法和等电点沉淀法经常结合使用，是目前常用的工业化大规模回收α-乳白蛋白的方法，但获得的蛋白还需要去除盐离子，且蛋白纯度较低。选择性热聚合法和双水相萃取法目前在工业应用上尚不成熟，仍停留在实验室级别。膜分离法是一种绿色的物理分离方法[20-21]，在分离过程中无热及化学变化，不会改变蛋白质的结构。因此，膜分离法是工业级分离α-乳白蛋白的关键技术之一[22]，其缺点是分离过程中会造成膜污染，α-乳白蛋白的回收率较低。色谱纯化法是分离得到高纯度α-乳白蛋白最有效的技术，且回收率很高，该技术目前较为成熟。

本文提供了一种牛乳中α-乳白蛋白的分离纯化工艺。第一阶段，以牛乳为原料，经过脱脂后利用膜分离法分段回收乳蛋白，可以得到富集α-乳白蛋白的截留液，即α-乳白蛋白粗品。以不同孔径的超滤膜分段截留乳蛋白，可以减少膜污染，提高分离效率，获得低纯度的α-乳白蛋白。第二阶段，以蛋白粗品为原料，采用色谱法分离纯化，相较于直接从乳清中分离，可以获得更高纯度的α-乳白蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牛乳，吉林春光乳业有限公司；CHY-MAX凝乳酶（～2235 IMCU/g），科汉森公司；乳酸，郑州康本生物科技有限公司；柠檬酸，潍坊英轩实业有限公司；盐酸、硫酸、氢氧化钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸二氢钾，北京化工厂；凯氏定氮催化片，青岛雅各化学试剂有限公司；SDS-PAGE试剂盒，碧云天生物技术；α-乳白蛋白标准品（≥92.2%），美国Agropur公司；管式陶瓷膜（0.1μm、0.45μm）、卷式聚砜膜（100 ku、50 ku、10 ku）、10 ku再生纤维素膜，北京赛普瑞特设备有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow，美国GE公司；Waters SymmetryⓇC18液相色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm），美国Waters公司；乙腈、三氟乙酸（色谱纯），美国Tedia公司；其它试剂，均为国产分析纯。

Beckman CouLTER AvantiJ-E高速离心机，美国贝克曼公司；ZY-MU-4-1000中试型微滤超滤膜分离系统、ZY-UNR-4040中试型超滤膜分离系统，上海紫裕生物科技有限公司；盖勃离心机，吉林省圣泽科技有限公司；K1100全自动凯氏定氮仪，海能未来技术集团股份有限公司；Chemi Doc凝胶成像仪、Mini-PROTEAN Tetra电泳系统，美国伯乐公司；DHL-A电脑恒流泵、CXG-1电脑恒温层析柜、HD-3紫外检测仪，上海青浦沪西仪器厂；DGU-20A3高效液相色谱仪，日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 乳脂肪的分离

将市售鲜牛乳预热至38～42℃，采用离心法将牛乳离心脱脂，离心转数为7 000 r/min，离心后分别得到脱脂乳和稀奶油。利用盖勃法测定鲜牛乳、稀奶油和脱脂牛乳中的乳脂肪含量，采用凯氏定氮法测定3种样品中蛋白质含量。

1.2.1.1 乳脂肪的含量测定

样品中乳脂肪的含量测定参照GB 5413.3-2010[23]。用蒸馏水将浓硫酸按1∶9的比例稀释成90%的硫酸。在乳脂计中依次加入90%硫酸、样品、蒸馏水和异戊醇，体积比为10∶5∶6∶1，上下震荡使溶液混匀。将乳脂计置于盖勃离心机中离心数次，直至脂肪层上浮。读乳脂计上的示数，其数值的2.2倍即为样品中乳脂肪的含量。

1.2.1.2 蛋白质的含量测定

样品中蛋白质的含量测定参照GB 5009.5-2010[24]。设置实验组及对照组，实验组在消化管加入样品、催化片及浓硫酸，对照组加入等量的催化片和浓硫酸。将样品消化，当其颜色变为亮绿色时停止加热，消化溶液的温度恢复至室温后，利用全自动凯氏定氮仪滴定样品，计算蛋白质含量。

1.2.2 酪蛋白沉淀及乳清的分离

比较酸沉法和酶凝法分离酪蛋白的效果。以1.2.1中回收得到的脱脂乳为原料，分别使用柠檬酸、盐酸、乳酸和凝乳酶处理脱脂乳。分别使用1 mol/L的盐酸、乳酸和柠檬酸调节等体积脱脂乳的pH至4.6，37℃静置1 h后回收上清液。同样的，在等体积脱脂乳中添加0.01%（w/w）的凝乳酶，混合均匀，37℃静置1 h后回收上清溶液。按照实验1.2.1.2操作步骤，测定分离得到的上清液中蛋白质的含量，选择最佳的分离乳清的方法。

1.2.3 乳清的微滤除菌

回收1.2.2中最佳处理法得到的乳清，调节pH为6.8，在35℃、出口压力为0.2 MPa的条件下经陶瓷膜过滤，截留上清液中的细菌。选择0.1μm和0.45μm的陶瓷膜过滤上清液，将过滤后回收的截留液用去离子水稀释到原来体积，再次过滤，该过程重复两次，提升透过液蛋白含量。收集微滤的截留液和透过液，分别检测其蛋白质含量和细菌数量，计算细菌去除率，细菌数量采用平板计数法（GB4789.2-2016）[25]。

1.2.4 超滤富集α-乳白蛋白

回收1.2.3微滤得到的乳清蛋白溶液，在35℃、出口压力为0.2 MPa的条件下，经10 ku的超滤聚砜膜和再生纤维素膜过滤，收集经两种膜材过滤得到的截留液，测定其蛋白质含量，筛选最佳的超滤膜材。以最佳超滤膜材分段富集α-乳白蛋白。

选用100 ku超滤膜截留乳清中的大分子蛋白，回收滤过液Ⅰ，经50 ku超滤得滤过液Ⅱ，滤过液Ⅱ经10 ku的超滤膜截留后，回收截留液Ⅰ，即得富集α-乳白蛋白的溶液组分。由于α-乳白蛋白主要存在于截留液Ⅰ中，根据设备最佳反应温度范围，设置10 ku超滤膜的膜过滤温度，超滤温度分别为25℃、35℃、45℃，调节膜压力为0.1、0.2、0.3 MPa，对每组实验得到的截留液进行蛋白质含量测定，确定最佳的超滤条件。在最佳反应条件下回收得到富集α-乳白蛋白的溶液，通过高效液相色谱法计算纯度。

1.2.4.1 高效液相色谱检测条件

使用Waters SymmetryⓇC18液相色谱柱对分离得到的α-乳白蛋白粗品进行检测分析。色谱检测条件：流动相A为含1%三氟乙酸的水溶液，流动相B为含1%三氟乙酸的乙腈溶液，检测流速为0.5 mL/min，进样体积为10μL，检测波长为280 nm，柱温为25℃，洗脱梯度条件如表1所示。

表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱条件

1.2.5 阴离子交换色谱法分离纯化α-乳白蛋白

回收1.2.4中得到的α-乳白蛋白粗品，经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱进行纯化。将α-乳白蛋白粗品加到DEAE Sepharose Fast Flow凝胶柱中，使用含0～0.3 mol/L NaCl的0.05 mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱，收集目标蛋白溶液，透析24 h后浓缩，得到纯度较高α-乳白蛋白溶液。采用高效液相色谱测定其纯度，检测条件同1.2.4.1所述。回收的α-乳白蛋白溶液，在进料温度为135℃、出料温度为70℃的条件下喷雾干燥，制备纯度较高的α-乳白蛋白粉。

1.3 数据处理

数据取3次平行试验的平均值，样品间差异利用单因素方差分析进行比较。采用SPSSStatistics 19进行统计学分析，用GraphPad Prism 8作图分析。

2 结果与分析

2.1 乳脂肪的分离

牛乳、脱脂乳和稀奶油的脂肪及蛋白质含量变化如图1所示，3者的蛋白质含量差别较小，牛乳的乳脂肪含量为3.7±0.0136%。离心脱脂后，脱脂乳的乳脂肪含量为0.044±0.0016%。脱脂过程中会造成部分蛋白质损失，损失率为10.132±0.0126%。

图1 鲜牛乳脱脂前后脂肪及蛋白质含量比较

2.2 酪蛋白沉淀及乳清的分离

实验比较了4种回收乳清的方法。可以发现，乳酸凝乳后分离出的酪蛋白颗粒较大，盐酸凝乳酪蛋白颗粒较小，柠檬酸介于中间。图2是不同分离方法回收乳清的电泳图，泳道M是标准蛋白，泳道1～5分别为柠檬酸、盐酸、乳酸和凝乳酶处理后回收的乳清。根据电泳图的条带对比发现，酸沉法和酶凝法回收的乳清中几乎没有酪蛋白条带，说明酪蛋白去除率较高。如表2所示，乳酸和凝乳酶作用后回收的乳清中蛋白质含量较高。综合考虑实验结果，最终采用酸沉法回收乳清，且乳酸为分离酪蛋白和乳清的最佳试剂。

表2 不同分离方法回收乳清中蛋白含量比较

图2 不同分离方法回收乳清的电泳图

2.3 乳清的微滤除菌

如图3所示，比较了两种孔径的陶瓷膜微滤乳清后截留液和滤过液中的蛋白质含量，0.45μm孔径微滤膜透过液蛋白质含量高于0.1μm的陶瓷膜，两组不同孔径的膜对乳清微滤后的除菌率可达99%以上。经过0.45μm陶瓷膜处理的滤过液蛋白质含量为6.53±0.22 mg/mL。综合除菌率和滤过液蛋白质含量，选择0.45μm孔径的陶瓷膜对乳清进行微滤处理。

2.4 超滤富集α-乳白蛋白

经50 ku聚砜膜获取得到的滤过液蛋白质含量为0.2294±0.0145 mg/mL。同等质量的透过液经两种不同材质超滤膜过滤，回收的截留液中蛋白质的含量分别为0.1884±0.0279 mg/mL和0.1790±0.0239 mg/mL，经聚砜膜超滤回收的蛋白质含量高于再生纤维素膜。因此选择10 ku的超滤膜材来截留富含α-乳白蛋白的滤液。

不同条件下10 ku聚砜膜截留液蛋白质含量如图4所示，在不同温度和压力下比较超滤截留液中蛋白质含量。结果显示，聚砜膜在35℃、0.3 MPa的条件下，对乳清的超滤效果较好，截留液中的蛋白质含量高于其他实验组。

图4 不同条件下10 ku聚砜膜截留液蛋白质含量

综上，使用聚砜超滤膜对乳清中的蛋白分段截留，在最佳超滤条件下回收富集了α-乳白蛋白的截留液，按照1.2.4.1的高效液相色谱检测条件，测定样品中α-乳白蛋白的含量如图5所示，经计算，超滤样品中α-乳白蛋白的含量为24.28±0.32%。

图5 α-乳白蛋白粗品高效液相色谱图

2.5 阴离子交换色谱分离纯化α-乳白蛋白

利用DEAE Sepharose Fast Flow二次纯化超滤回收的α-乳白蛋白粗品，洗脱液梯度洗脱后，回收洗脱液，透析24 h。经过高效液相色谱检测发现，如图6所示，经阴离子交换色谱纯化的蛋白样品中含较少量β-乳球蛋白。经阴离子交换色谱纯化的样品中，α-乳白蛋白的纯度为90.89±0.31%，在乳清中的回收率为79.02±0.13%。

图6 色谱纯化后α-乳白蛋白高效液相色谱图

3 结论

经离心法脱脂处理的牛乳，乳脂肪回收率可达99%以上。实验比较了不同酪蛋白沉淀的方法，以乳清中蛋白质含量为指标，最终选择乳酸沉淀酪蛋白，获得的乳清蛋白质含量为11.2267±0.0240 mg/mL。乳清溶液经0.45μm孔径的陶瓷膜微滤除菌后，选择10 ku的卷式聚砜膜超滤富集α-乳白蛋白，优化超滤参数，在35℃、出口压力为0.3 MPa的条件下，超滤截留液中蛋白质含量最高，样品中α-乳白蛋白的含量为24.28±0.32%。利用阴离子交换色谱将α-乳白蛋白粗品二次纯化，获得的α-乳白蛋白纯度可达90.89±0.31%，在乳清中的回收率为79.02±0.13%。