冻干羊奶中伊维菌素基体标准物质的研制

杨赵伟，李博，李宏娟，李曼，张养东，李鹏，杜顺丰

（1.秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北秦皇岛066000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心,北京100193）

0 引言

伊维菌素是由阿维链霉菌发酵产生的半合成大环内酯类抗生素[1]，既不属于抗菌化合物，也不属于抗真菌化合物[2]，在动物寄生虫防治中广泛使用[3]。牛、羊等反刍动物通常采用皮下或肌肉注射伊维菌素[4]，药物在皮下组织中的沉积，可能造成奶中药物污染[5-6]，并在牛奶和羊奶中持续存在[7]。牛奶中伊维菌素的限量为10μg/kg[8]，而羊奶无相关规定，滞后于羊奶产业的快速发展[9-11]。

基体标准物质可以保障测试结果的准确性和质量控制的有效性[12]，我国食品类标准物质与实际需求有巨大缺口[13]，其中乳制品标准物质缺失更为严重。乳制品基体标准物质在乳制品检验工作中具有重要作用[14]。本试验研制的冻干羊奶中伊维菌素标准物质，可用于羊乳中伊维菌素检测过程中质量控制和方法验证。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

U 3000高效液相色谱仪，配有FLD-3100荧光检测器，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；YZ-1A-80冷冻干燥机，北京岩征生物科技有限公司；MS3漩涡振荡器，IKA公司；3H 20RI智能高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；USE-24S固相萃取浓缩装置，北京优晟联合科技有限公司；TTL-Ⅱ氮吹仪，北京斯珀特科技有限公司；XA205电子天平，梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；HZF-A200电子天平，福州华志科学仪器有限公司；BC/BD-100HER冰柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司。

体况良好、体质量35.36±3.82 kg相近的泌乳期奶山羊3只，卢龙县亚川养殖场；伊维菌素注射液（质量浓度为10 mg/mL），四川维尔康动物药业有限公司；伊维菌素标准品（纯度≥94%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；甲醇（色谱纯），德国CNW公司；乙腈（色谱纯），德国CNW公司；冰乙酸（色谱纯），沈阳市试剂五厂；三氟乙酸酐（化学纯），南京化学试剂股份有限公司；三乙胺（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；异辛烷（色谱纯），德国CNW公司；N-甲基咪唑（色谱纯），西亚试剂；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 标准物质的制备和使用方法

1.2.1 标准物质的制备

首先，将3只健康且处于泌乳中期的奶山羊,早晨挤奶后，按每1 kg体质量0.02 mL皮下注射伊维菌素。注射24 h后挤奶，弃去起始部分羊奶，避免微生物污染，将收集的羊奶按只存储、自然降温、4℃保存。同时，参照《GB/T 29696-2013牛奶中阿维菌素类药物多残留的测定高效液相色谱法》的方法[15]，称取2 g样品，测定羊奶中伊维菌素的质量浓度。实验测得羊奶中伊维菌素质量浓度为16.3～20.0μg/mL，将羊奶按一定比例混合，并用纯净的羊奶调整伊维菌素的质量浓度至15μg/mL左右，缓慢混匀。然后，使用电子天平将羊奶准确分装至洁净的西林瓶中，每瓶11.20 g，西林瓶迅速放置在不高于-20℃冰柜中预冻干不低于12 h，将盛有冻结羊奶的西林瓶在冷冻干燥机中进行真空冻干，冷冻干燥机的冷阱温度-80℃、真空度1 Pa，冻干时间不低于96 h。最后，将冻干后的西林瓶先加丁基胶塞，再加盖铝塑盖，转移至不高于-20℃冰箱保存。

1.2.2 标准物质的使用方法

将盛有冻干羊奶的西林瓶从冰箱中取出，恢复至室温，用10 mL单标线吸量管加入纯水溶解。加水溶解时，先少量加水，静置数秒，待西林瓶中冻干羊奶部分溶解并有足够的空间后加入剩余纯水，充分溶解、混匀，供试。

1.3 标准物质的均匀性检验

该实验制得标准物质的数量为300个，依据JJF 1006-1994[16]、JJF 1343-2012[17]的相关规定，从实验总样本中随机抽取15瓶，进行单元间均匀性检测，每瓶平行测定3次，进行单元内均匀性检测。使用上述高效液相色谱法定量，对检测结果进行单因素方差分析（F检验法），评价样品的均匀性。

1.4 标准物质的稳定性检验

依据JJF 1006-1994[16]、JJF 1343-2012[17]的相关规定，按照先密后疏的原则，进行短期稳定性和长期稳定性考察。在25℃条件下，于0，1，4，7，14 d检测样品中的伊维菌素含量，考察样品的短期稳定性；在4℃和-20℃条件下，于0，1，2，4，6月检测样品中的伊维菌素含量，考察样品的长期稳定性。每次检测随机取3瓶标准物质样品，每瓶样品平行测定3次，取3次数据的平均值作为最终定量结果。

使用上述高效液相色谱法定量，采用（经典）线性模型对定量结果进行分析，考察线性关系的斜率随样品稳定性变化的变化值。稳定性评估基本模型表示公式为Y=β0+β1X,β0、β1为回归系数，X为时间，Y为标准物质的特性值。

斜率估算公式为

截距计算公式为

β1的标准偏差s(β1)计算公式为

直线上每点的标准偏差s计算公式为

式中：Xi是第i个时间点；Yi是第i个时间点的观测值；是所有时间点的平均值；是所有观测值的平均值；n是测量次数。

基于β1的标准偏差，用t-检验进行判断，若|β1|

1.5 标准物质的定值和不确定度评定

1.5.1 标准物质的定值

依据JJF 1343-2012[17]的相关规定，本研究选择8家通过资质认定的实验室，使用上述定量方法，为该标准物质合作定值。每家实验室测定3个样品，每个样品测定2次，各实验室报告单次测量结果用于数据评估和标准值的确定。

所得测量结果的正态分布检验使用夏皮洛-威尔克法，其统计量为；本研究中n=48，则分子下标的K值为1～24，系数aK由JJF 1343-2012[17]中表D.4查得。若统计量W>W(n，p)，则所得数据为正态分布。

组内可疑值检验使用迪克逊检验，将测定数据按由小到大的顺序排列，按JJF 1343-2012[17]中表F.1计算r1值和rn值，查找f（a，n），若r1和rn值均小于f（a，n），则所有数据保留。

所有数据经评估合格后，计算总平均值作为标准值。

1.5.2 不确定度评定

依据JJF 1343-2012[17]的相关规定，标准物质定值结果的不确定度包括标准物质的均匀性引起的不确定度、标准物质的稳定性引起的不确定度以及标准物质的定值过程带来的不确定度。均匀性引起的不确定度为

式中：sbb为瓶间标准偏差；和分别为组间方差和为组内方差（见表1）；n为组内测量次数3。

稳定性引起的不确定度us包括长期稳定性不确定度ults和短期稳定性不确定度usts，us=s(β1)·X，式中s(β1)为β1的标准偏差（见表2，表3），X为保存期限。

8家实验室使用一种方法联合定值，定值引入的不确定度为平均值的标准偏差，即

式中：Yi为各实验室定值结果平均值；Y为各实验室定值结果总平均值（见表4）；p为参与定值实验室数量；s为各实验室定值结果平均值的标准偏差。

计算上述各不确定度的相对不确定度ubb,rel、ults,rel、usts,rel、uchar,rel，合成不确定度为

k=2时，相对扩展不确定度UCRM,rel=k·uCRM。最终可计算扩展不确定度。

2 结果与讨论

2.1 样本的制备和使用方法

本实验通过皮下注射伊维菌素，使泌乳羊生产含有伊维菌素的羊奶，经混合、分装、冻干、评审、定值而得，是为自然基体标准物质。该类标准物质虽然目标药物浓度低于加料基体标准物质，然而与实际样品基本一致，真实的反映了药物在动物体内代谢结合的情况[12]。

本研究中伊维菌素的注射量严格参照药物的使用说明执行，所得样品与生产中羊奶一般无二。经测定，羊奶中伊维菌素含量为16～20μg/mL，高于牛奶中伊维菌素的残留限量[8]，因此，有必要开展羊奶中伊维菌素的检测和标准物质的制备。混合调整伊维菌素浓度至15μg/mL左右，该浓度高于残留限量，略低于现实样品，且与两者接近，便于标准物质的制备，反应真实样品的测量情况，可以很好的控制检测效果，满足实际监测的需要。

药物残留基体标准物质多采用冻干的方式保存[18-22]，冻干粉均匀性好、稳定性好、易保存，可以通过复水或其他手段使得冻干粉尽可能恢复日常分析形态，但是与实验室任务样本形态往往不同[23]。本研究一个西林瓶分装11.20 g样本，冻干后，需要10.00 mL纯水复溶，使用10 mL单标线吸量管移取，方便、准确，复溶后的标准物质形态与任务样本相同。需要注意的是，复溶后的样本应尽快使用，不得留存。

2.2 均匀性检验

均匀性是标准物质重要属性之一，是标准物质顺利研制的基础[24]，凡成批制备并分装成最小包装单元的标准物质，必须进行均匀性检验[16]。本实验中分装时缓慢搅拌，避免出现静置沉淀现象，使用电子天平分装，复溶时用单标线吸量管，保证了标准物质的均匀性。该标准物质的均匀性检验结果如表1所示，如表所示统计量F小于F0.05(14,30)，符合JJF 1006-1994[16]中均匀检验合格要求。因此，该冻干羊奶中伊维菌素标准物质均匀。

表1 羊奶中伊维菌素均匀性检测结果 μg/kg

2.3 稳定性检验

稳定性是标准物质又一重要属性，稳定性检验是标准物质研制中的关键环节[25]。标准物质的长期稳定性与生产者的贮存条件有关，短期稳定性与样品运输过程的环境条件有关。羊奶营养丰富、水分含量高，常温条件只能短期保存。本研究使用冷冻干燥技术得到羊奶冻干粉，使羊奶及其含有药物残留便于长期保存和运输，快速复溶，便于使用。该标准物质的稳定性检验结果见表2和表3，如表所示若长期稳定性和短期稳定性的斜率的绝对值|β1|均小于临界值t0.95,n-2·s(β1),符合JJF 1343-2012[17]中稳定性检验合格要求，该冻干羊奶中伊维菌素标准物质在本实验条件下和时间内稳定。

表2 长期稳定性检验结果 μg/kg

表3 短期稳定性检验结果 μg/kg

2.4 定值和不确定度评定

基体标准物质研制目的在于增强不同实验室测量结果互认，因此，本实验采用8家实验室协同定值，如表4所示。该标准物质定值时伊维菌素在高效液相色谱和超高效液相色谱均可以取得良好的峰形和响应，见图1和图2。各实验室检测结果见表4，对检测结果进行评估，结果见表5。如表所示，所有数据全部保留，该标准物质定值结果为8家实验室测定结果的总平均值为15.3μg/kg。

表4 羊奶中伊维菌素基体标准物质定值数据 μg/kg

图1 冻干羊奶中伊维菌素在高效液相色谱定值谱

图2 冻干羊奶中伊维菌素在超高效液相色谱定值谱

表5 定值数据评估结果

标准物质定值结果的不确定度来源包括均匀性、稳定性和定值过程[17]。计算各来源不确定度和相对不确定度，合成标准不确定度，最终计算扩展不确定度，计算过程各分量和结果如表6所示。

表6 不确定度评定结果

综合定值和不确定度评定结果，羊奶中伊维菌素基体标准物质定值结果（以羊奶计）为15.3±1.0μg/kg，k=2。

3 结论

本实验通过给泌乳羊皮下注射伊维菌素，将得到羊奶经混合、分装、预冻干、冻干等步骤，制得一批冻干羊奶中伊维菌素自然基体标准物质。该标准物质均匀性和稳定性良好，其特性值（以羊奶计）为（15.3±1.0）μg/kg，k=2。该标准物质可满足生鲜羊乳中伊维菌素检测过程中质量控制和方法验证的需求，确保检测结果的可靠性、可比性和溯源性，对增强不同实验室测量结果互认、提高我国生鲜羊乳中伊维菌素检测水平具有积极的意义。