生姜天然产物的提取及其对茶轮斑病的室内毒力强度

饶家瑞， 张 欣， 余用秀

(1.贵州省茶叶研究所， 贵州 贵阳 550006； 2.贵州省生物技术研究所， 贵州 贵阳 550006)

中国是茶叶生产第一大国，也是茶叶出口第二大国，但近年随着国外对茶叶进口农药最大残留限定标准的提高，致使每年损失数亿美元[1]；在农药残留限量标准中绝大部分是化学农药[2]。因此，为使茶叶农药残留标准符合最大残留限定、减少茶叶病害防控中化学农药的施用，利用植物次生代谢产物进行茶叶病害防控，保障茶叶绿色安全生产具有重要的意义。植物中蕴含的天然产物种类繁多[3]，而生姜作为常见的烹饪调料植物，富含酚类、萜类、生物碱类和黄酮类等众多植物次生代谢产物，具有增强免疫力、抗氧化和抑菌等生物活性[4-5]。有研究表明，生姜精油对病菌有一定的抑制作用，如对枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为2.3 μg/mL和4.6 μg/mL、9.2 μg/mL和18.4 μg/mL[6]；对腐皮镰刀菌、油菜菌核病菌和立枯丝核菌的IC50分别为396.39 mg/L、439.73 mg/L和146.83 mg/L[7]；10-姜酚对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7细胞用药72 h后表现出最佳的抑制作用，其IC50分别为25.80 μmol/L和35.29 μmol/L[8]；生姜提取物∶柠檬酸=1.22∶1对金黄色葡萄球菌和啤酒酵母的抑菌活性分别为15 mg/mL和8 mg/mL[9]。为筛选出对茶树茶轮斑病病害防控有效的植物源农药，减少茶园化学农药施用量，实现茶叶绿色环保安全生产，笔者采用有机溶剂浸提和超声波辅助方法[10-11]，提取生姜中蕴含的天然产物，并利用菌丝生长速率法测试生姜提取天然产物对茶轮斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)的室内毒力强度，以期利用生姜天然提取物防治茶轮斑病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶轮斑病病原菌 病原菌为2020年7月张欣等[12]从贵州省铜仁市石阡县采集，经分离、形态学鉴定、DNA比对和致病性鉴定为茶轮斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)，由贵州省生物技术研究所提供。

1.1.2 药剂 二氯甲烷、乙酸乙酯，购于天津市富宇精细化工有限公司；甲醇，购于上海麦克林生化科技有限公司；乙醇，购于天津市致远化学试剂有限公司；土豆培养基(PDA)，购于广东环凯微生物科技有限公司；二甲基亚砜，购于上海阿拉丁生化股份有限公司；吐温80，购于天津市大茂化学试剂厂；其他试剂，购于上海安耐吉化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器 德意生超声波清洗机(深圳市华策科技有限公司)，超净工作台(苏净集团安泰公司)，电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)，电子天平(型号：BSA224S-CW)，恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，高温蒸汽灭菌锅(上海沉汇仪器有限公司)，研钵80 mm(河北鼎盛隆华实验仪器有限公司)，旋转蒸发仪(德国IKA)，BHC-1300II A/B3生物洁净安全柜，Mill-Q型超纯水制备仪，20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL移液枪等。

1.2 方法

1.2.1 生姜天然产物提取 将凯里生姜去皮洗净，分别在电子天平上称量30 g，共4组。将每组生姜切成小块放入研钵中反复研磨，参照有机溶剂浸提法[10]和超声波辅助提取法[11]，分别在4组研磨后的生姜中加入二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇，置于超声波清洗仪中以30℃超声10 min。用滤纸过滤提取液，再将过滤液分别装入100 mL圆底烧瓶中旋转蒸馏除去溶剂，得到生姜提取天然产物。

1.2.2 提取天然产物的抑菌活性试验

1) 培养基配制。将3 L超净水注入5 L烧杯中，加入土豆培养基120 g、琼脂 40 g，并用玻璃棒搅拌均匀。在搅拌状态下将配置的培养基以每瓶45 mL倒入100 mL锥形瓶中并封口，在121℃条件下高压灭菌20 min，冷却后备用。

2) 药液配制。按1 mg天然产物使用20 μL二甲基亚砜溶解的比例，将提取的天然产物配成溶液置于2 mL离心管中备用[处理1：二氯甲烷提取天然产物；处理2：乙酸乙酯提取天然产物；处理3：甲醇提取天然产物；处理4：乙醇提取天然产物；处理5(CK1)：阳性对照药剂春雷霉素；处理6(CK2)：空白对照，等量灭菌吐温水]。在紫外灭菌30 min以上的超净工作台上，将200 μL吐温80加入200 mL灭菌水中搅拌均匀，按照每种天然产物5个浓度梯度对应5只10 mL离心管进行配药。每只10 mL离心管中依次加入0.8 mL吐温水、200 μL对应天然产物配置液和4 mL吐温水。将配置好的5 mL药液倒入PDA培养基中混匀(使50 mL含药液培养基的最终浓度为200 μg/mL)，再平均倒入3个培养皿中冷却备用。

3) 真菌接种。提前用75%酒精擦拭超净工作台消毒，打开紫外灯30 min以上。将提前活化好的茶轮斑病病原菌(Pestalotiopsistrachicarpicola)置于消毒后的超净工作台上，用打孔器在其边缘打孔并制成直径为4.0 mm的菌饼。再用无菌接种针将菌饼移置到含有药液的培养皿中央，每处理重复3次。最后，将接种后的培养皿置于25℃、80%湿度的恒温培养箱中培养5 d。待空白对照组菌丝长至6.0 cm左右时，采用十字交叉法测量生长菌丝的菌饼直径，并计算抑制率(I)。

I=[(C-T)/(C-0.4)]×100%

式中，C为空白对照菌饼直径，T为药物处理菌饼直径。

1.2.3 提取天然产物抗茶轮斑病的毒力测定 根据生姜提取天然产物在200 μg/mL浓度下对茶轮斑病的初筛抑制率，选择处理1的浓度梯度为400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL；处理2的浓度梯度为200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL和12.5 μg/mL；处理3和处理4的浓度梯度为1 600 μg/mL、800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL和100 μg/mL，进行4组天然产物的EC50测定。另设阳性对照组处理5(CK1，药物为春雷霉素)、空白对照组处理6(CK2，等量灭菌吐温水)。每处理重复3次。利用菌丝生长速率法测定生姜提取天然产物的抑菌活性，采用十字交叉法测量生长菌丝的菌饼直径，并计算抑制率，取浓度对数与抑制率做线性回归方程，从而计算得出EC50。

1.3 数据分析

数据采用Excel 2010和DPS软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 生姜提取天然产物的产率

从表1可知，生姜提取天然产物的产率依次为乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，其产率分别为4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。甲醇和乙醇提取物质以亲水性的酚类、醛类和萜类等为主，二氯甲烷和乙酸乙酯提取物质以亲脂性的黄酮类、生物碱等为主。

表1 4种溶剂提取生姜天然产物的产率

2.2 不同处理茶轮斑病病原菌的抑制率

从表2可知，在200 μg/mL浓度下4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病病原菌的抑制率以处理2最高，为56.67%，较CK1高26.37百分点；处理1其次，为43.33%，较CK1高13.03百分点；处理1、处理2均与CK1间差异极显著。处理3和处理4的抑制率分别为19.09%和12.73%，分别比CK1少11.21百分点他17.57百分点。说明，二氯甲烷和乙酸乙酯亲脂性溶剂提取生姜天然产物的活性优于甲醇和乙醇溶剂提取。

表2 不同处理茶轮斑病病原菌的抑制率

2.3 不同处理浓度茶轮斑病病原菌的抑制率与EC50

2.3.1 抑制率 从表3看出，在200 μg/mL和100 μg/mL浓度下，4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病病原菌的抑制率均以处理2最高，抑制率分别为57.44%和38.39%，分别比同浓度下的处理1、处理3、处理4高5.65百分点和2.08百分点、37.20百分点和30.35百分点、43.15百分点和33.93百分点。4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病病原菌的抑制率随浓度下降而降低，且各浓度间差异均达极显著。

表3 不同处理及浓度下茶轮斑病病原菌的抑制率

2.3.2EC50从表4可知，4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病的毒力方程的相关系数(R2)均大于0.95，表明4种溶剂提取生姜天然产物的浓度与抑制率间均存在良好的线性关系。处理1～处理4的EC50分别为179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL。其中，处理1、处理2的EC50分别比CK1减少用药量190.58 μg/mL和220.01 μg/mL。说明，乙酸乙酯溶剂提取生姜天然产物的毒力强度最大，二氯甲烷溶剂其次，且两者抗茶轮斑病的效果均优于阳性对照药剂春雷霉素。

表4 不同处理茶轮斑病病原菌的毒力回归方程及EC50

3 结论

1) 用4种不同有机溶剂从凯里生姜中浸提天然产物的产率依次为乙醇>甲醇>二氯甲烷>乙酸乙酯，产率分别为4.13%、2.62%、0.71%和0.45%。

2) 抑菌活性试验结果表明，在200 μg/mL浓度下，4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病病原菌的抑制率以乙酸乙酯溶剂最高，为56.67%，较对照药剂春雷霉素增加26.37百分点；二氯甲烷溶剂其次，为43.33%，较对照药剂春雷霉素增加13.03百分点；二氯甲烷溶剂和乙酸乙酯溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病的抑菌活性均极显著高于对照药剂春雷霉素。

3) 毒力强度试验结果表明，在不同浓度下，4种溶剂提取生姜天然产物对茶轮斑病病原菌的抑制率均随浓度下降而降低，且各浓度间差异均达极显著。二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和乙醇4种溶剂提取生姜天然产物的EC50分别为179.89 μg/mL、150.46 μg/mL、713.24 μg/mL和742.60 μg/mL，且二氯甲烷、乙酸乙酯溶剂提取生姜天然产物的EC50分别比对照药剂春雷霉素的EC50(370.47 μg/mL)小190.58 μg/mL和220.01 μg/mL，即乙酸乙酯溶剂提取生姜天然产物的毒力强度最大，二氯甲烷溶剂其次，且两者抗茶轮斑病的效果均优于阳性对照药剂春雷霉素。