枯草芽孢杆菌JY24菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶发酵工艺优化及催化转化

高书锋，孔利华，雷 平，曾发姣，王升平，龚 平，周小玲，刘惠知

(湖南省微生物研究院，长沙 410009)

β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase，GUSB)，是一种糖苷类水解酶，多属于糖基水解酶家族2和79，能催化各类含β-D-糖苷键的化合物水解。当前优化微生物菌株产该酶文献报道较少，Chouiter等[1]对树舌灵芝产β-D-葡萄糖醛酸苷酶培养基和补料方式进行优化，发酵14 d酶活提高5倍，达1.09 U/mL；张斌等[2]对毕赤酵母高效表达重组β-D-葡萄糖醛酸苷酶诱导方法进行了研究，发酵5 d高效表达GAMG的酶活达1 970 U/mL；郭晓晓等[3]对产紫青霉β-D-葡萄糖醛酸苷酶的诱导表达进行了研究，初始葡萄糖耗尽时，继续诱导3 d和发酵2 d，酶活达2 356 U/mL，提高近3倍；吴文婷[4]对ChaetomiumglobosumS108菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶工艺进行了研究，发酵4 d酶活达900 U/mL；Ku等[5]对德氏乳杆菌Rh2产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的66种培养基优化筛选，厌氧发酵18 h，相对酶活提高8倍。上述优化微生物菌株产该酶文献报道所用菌种多属真菌，代谢产酶周期较长，为4 d至14 d，而德氏乳杆菌Rh2虽为细菌菌株，但产酶发酵方式为厌氧发酵，实际生产有一定困难。当前有关好氧细菌产该酶的发酵工艺优化研究尚未见报道，加之细菌具有代谢产酶周期短的优势，因此，有必要针对本实验室前期试验从健康鸡肠道选育的产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的饲用枯草芽孢杆菌JY24菌株，开展产酶发酵工艺优化，为后续工作中提升黄芩苷转化率和转化效率提供借鉴和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JY24菌株，湖南省微生物研究院动物营养与疫病防控室分离选育保存。

1.1.2 培养基

种子培养基：LB培养基；基础发酵培养基：淀粉8 g、蛋白胨10 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钠5 g、黄芩苷诱导物1 g、蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要试剂和仪器

标准品：对硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷，Sigma Aldrich(>99%，质量分数)；对硝基苯酚，Dr.Ehrenstorfer GmbH(99.4%，质量分数)。TGL20M-II冷冻离心机、Tu-1810分光光度计、ZQZY-AS9振荡培养箱、LRH400A生化培养箱和Agilent1260高效液相色谱仪。

1.2 方法

1.2.1 β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活检测

(1)标准曲线绘制。称取0.347 8 g对硝基酚，PBS定容至100 mL，摇匀，吸取4 mL，PBS定容至100 mL，即储备液。稀释储备液为10～100 μmol/L系列标准液，检测OD405，选择合适梯度绘标准曲线。(2)酶活检测。参照文献[6]进行。酶活力单位：在pH 7.0、35 ℃条件下，每小时释放1 μmol对硝基苯酚所需酶量为1个活力单位，记为U。酶活单位(U/mL)=对硝基酚释放量(μmol)/保温时间(h)/被检液量(mL)。

1.2.2 发酵条件优化

发酵时间设9个处理：6、12、18、24、30、36、42、48和54 h；转速设4个处理：150、180、210和240 r/min；装液量设5个处理：10%、15%、20%、25%和30%；初始pH值设5个处理：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；温度设6个处理：29 ℃、31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃和39 ℃；接种量设5个处理：1%、2%、3%、4%和5%；上述不同处理均设3次重复。初始条件：采用三角瓶(500 mL)摇瓶发酵，接种量3%、初始pH 7.0、装液量20%、温度35 ℃、转速220 r/min。分别测定不同发酵条件下各处理3次重复发酵液的酶活性，优化发酵条件。

1.2.3 培养基成分优化

碳源、氮源和磷源种类筛选：计算基础发酵培养基碳源、氮源和磷源中碳、氮和磷含量，分别用6种碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、红糖、糖蜜和麦麸)、7种氮源(蛋白胨、酵母粉、酵母膏、黄豆粉、牛肉膏、硝酸钾和硫酸铵)和3种磷源(磷酸二氢钾、1/2磷酸二氢钾+ 1/2磷酸氢二钾、磷酸氢二钾)替换，优化碳、氮和磷源种类。无机盐种类筛选：去除基础发酵培养基所有无机盐，分别添加8种0.002 mol/L的无机盐(硝酸钾、氯化钠、氯化钙、七水硫酸镁、一水硫酸锰、三氯化铁、七水硫酸亚铁和五水硫酸铜)，CK不添加，优化无机盐种类。表面活性剂、生长因子种类和诱导物浓度筛选：表面活性剂设5个处理：PEG-400、Tween-20、Tween-80、TritonX-100和SDS，SDS添加浓度为1.0 g/L，其他添加浓度为1.0 mL/L，CK不添加；生长因子设3个处理：玉米浆、糖蜜和麦芽汁，添加浓度为2.0 mL/L，CK不添加；黄芩苷诱导物添加浓度设6个处理：0(CK)、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L，优化表面活性剂、生长因子种类和诱导物浓度。上述各处理均设3次重复，分别测定不同培养基成分各处理3次重复发酵液的酶活性，优化培养基成分。

1.2.4 培养基组成优化

据单因素试验结果，选出最佳碳源蔗糖、氮源酵母膏、磷源 (1/2磷酸氢二钾和1/2磷酸二氢钾)、2种主要无机盐(氯化钙和硝酸钾)、表面活性剂Tween-20和生长因子玉米浆，设计7因素3水平(表1)正交试验，选用L18(37)正交表进行试验，重复3次，分别测定各组合3次重复发酵液酶活性，结果进行直观和方差分析，优化培养基组成和酶活性。各正交试验组合均添加1.5 g/L黄芩苷诱导物。

表1 培养基组成正交试验因素和水平设计Table 1 The factors and levels for soforthogonal test of the fermentation medium

1.2.5 酶催化黄芩苷转化初步试验

(1)酶催化黄芩苷转化试验方法。采用试验最优产酶培养基，添加50 g/L 80目黄芩粉，在试验最佳产酶条件下，进行β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化黄芩苷转化试验，于发酵0 h和72 h分别检测发酵液黄芩苷和黄芩素含量，计算黄芩苷转化率，重复3次。黄芩素转化率=[(发酵72 h黄芩素含量-发酵0 h黄芩素含量)×1.651 7/发酵0 h黄芩苷含量]×100%(1.651 7为黄芩苷和黄芩素摩尔质量之比)。(2)黄芩苷、黄芩素含量检测方法。采用HPLC法，取适量发酵液，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，上清液用色谱级甲醇进行梯度稀释，超声萃取30 min，0.22 μm 聚偏氟乙烯微孔滤膜(F型)过滤，Agilent1260高效液相色谱检测。色谱条件：色谱柱Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)；检测波长275 nm；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；进样量10 μL；流动相为甲醇∶水∶磷酸(55∶45∶0.04)。黄芩苷浓度在2～100 μg/mL范围内线性关系良好，黄芩苷保留时间(tR=6.024 min)；黄芩素浓度在5～100 μg/mL范围内线性关系良好，黄芩素保留时间(tR=8.317 min)。

1.3 数据处理

采用SPSS16.0统计软件one-way ANOVA程序进行显著性分析，采用Duncan氏法进行处理间多重比较，P<0.05为差异显著性标准，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 发酵条件优化

2.1.1 发酵时间优化

发酵时间对发酵液酶活性影响结果(图1)显示：随发酵时间延长，酶活性先升后降，发酵时间为42 h时，酶活性最高，为36.43 U/mL，与其他发酵时间结果相比，均存在显著差异。发酵时间从18 h到42 h，发酵液产酶量逐渐增加，不同发酵时间处理间酶活性均存在显著差异。

图1 发酵时间对酶活性的影响Figure 1 Effect of fermentation time on enzyme activity

2.1.2 培养转速优化

转速对发酵液酶活性影响结果(图2)显示：随转速增加，酶活性不断增加，转速为240 r/min时，酶活性最高，为40.90 U/mL，与其他处理酶活性相比，均存在显著差异。

图2 转速对酶活性的影响Figure 2 Effect of rotational speed on enzyme activity

2.1.3 装液量优化

装液量对发酵液酶活性影响结果(图3)显示：随装液量增加，酶活性不断减小，装液量为10%时，酶活性最高，为47.59 U/mL，装液量为30%时，酶活性最低，为42.24 U/mL，10%装液量酶活性与20%、25%和30%装液量酶活性相比，均存在显著差异。

图3 装液量对酶活性的影响Figure 3 Effect of liquid culture volume on enzyme activity

2.1.4 培养基初始pH优化

初始pH对发酵液酶活性影响结果(图4)显示：随初始pH值升高，酶活性相对稳定而后急降，pH值为7.0时，酶活性最高，为48.71 U/mL，pH值为8.0时，酶活性显著下降，为12.10 U/mL。

图4 初始pH值对酶活性的影响Figure 4 Effect of initial pH on enzyme activity

2.1.5 发酵温度优化

温度对发酵液酶活性影响结果(图5)显示：随温度升高，酶活性先增后减，温度为35 ℃时，酶活性最高，为79.07 U/mL，与33 ℃处理酶活性相比无显著差异，与其他处理相比均存在显著差异；温度为39 ℃时，酶活性为6.52 U/mL，与其他各处理相比均显著下降。

图5 温度对酶活性的影响Figure 5 Effect of temperature on enzyme activity

2.1.6 接种量优化

接种量对发酵液酶活性影响结果(图6)显示：随接种量增加，酶活性先升后降，接种量为4%时，酶活性最高，为79.51 U/mL，接种量为3%和5%时，酶活性较高，分别为75.72 U/mL和77.06 U/mL，且3%～5%接种量之间无显著差异。4%接种量处理与1%和2%接种量处理相比，酶活性显著增加；3%和5%接种量处理，与1%接种量处理相比，酶活性显著增加。

图6 接种量对酶活性的影响Figure 6 Effect of inoculation amount on enzyme activity

2.2 培养基成分优化

2.2.1 碳源种类优化

碳源对发酵液酶活性影响结果(图7)表明：蔗糖为碳源时，酶活性最高，为142.14 U/mL；淀粉为碳源时，酶活性较高，为105.71 U/mL；而红糖、糖蜜为碳源时，酶活性差。各种碳源处理酶活性间均存在显著差异，表明碳源对发酵产酶具有重要影响作用，选择最佳碳源种类至关重要。

图7 碳源对酶活性的影响Figure 7 Effect of carbon source on enzyme activity

2.2.2 氮源种类优化

氮源对发酵液酶活性影响结果(图8)表明：酵母膏为氮源时，酶活性最高，为229.64 U/mL，与其他氮源处理相比，酶活性均显著增加；蛋白胨、黄豆粉为碳源时，酶活性较高，分别为142.28 U/mL和87.61 U/mL，与其他氮源处理酶活性相比，均存在显著差异，二者间亦存在显著差异。其他氮源酶活性较差，且无显著差异。

图8 氮源对酶活性的影响Figure 8 Effect of nitrogen source on enzyme activity

2.2.3 磷源种类优化

磷源对发酵液酶活性影响见图9：1/2磷酸二氢钾+1/2磷酸氢二钾为磷源时，酶活性最高，为189.43 U/mL；磷酸氢二钾为磷源时，酶活性最低，为168.09 U/mL，与其他两种磷源相比，存在显著差异。

图9 磷源对酶活性的影响Figure 9 Effect of phosphate source on enzyme activity

2.2.4 无机盐种类优化

无机盐对发酵液酶活性影响结果(图10)表明：氯化钙、硝酸钾、硫酸锰、三氯化铁、硫酸铜和硫酸亚铁为无机盐时，酶活性较高，分别为368.36、359.65、332.24、332.24、327.56和326.17 U/mL，均优于CK，且存在显著差异。其他无机盐种类处理酶活性低于CK。

图10 无机盐对酶活性的影响Figure 10 Effect of inorganic salts on enzyme activity

2.2.5 表面活性剂种类优化

表面活性剂对发酵液酶活性影响结果(图11)表明：添加Tween-20、Tween-80、TritonX-100和PEG-400时，酶活性分别为407.66、404.07、403.56和389.06 U/mL，与CK相比均显著增加；而添加SDS时，酶活性有所下降，与CK相比无显著差异。

图11 表面活性剂对酶活性的影响Figure 11 Effect of surfactant on enzyme activity

2.2.6 生长因子种类优化

生长因子对发酵液酶活性影响结果(图12)表明：添加玉米浆、糖蜜和麦芽汁时，酶活性分别为448.65、412.32和432.54 U/mL，与CK相比，添加玉米浆和麦芽汁处理酶活性均显著增加，而添加糖蜜处理无显著差异。

图12 生长因子对酶活性的影响Figure 12 Effect of growth factor on enzyme activity

2.2.7 诱导物浓度优化

诱导物浓度对发酵液酶活性影响(图13)表明：诱导物浓度为0时，未检测到酶活性；随添加浓度升高，酶活性先升后稍降，添加浓度为1.5 g/L时，酶活性最高，为488.65 U/mL，与诱导物添加浓度为2.0 g/L处理相比无显著差异，与其他诱导物浓度处理相比均显著增加。

图13 诱导物浓度对酶活性的影响Figure 13 Effect of induces concentration on enzyme activity

2.3 培养基组成优化

正交试验结果见表2。极差分析表明：影响发酵液酶活性主次因素关系：A(蔗糖)>B(酵母膏)>G(玉米浆)>D(氯化钙)>C(1/2磷酸氢二钾和1/2磷酸二氢钾)>E(硝酸钾)>F(Tween-20)；因素最佳水平组合：A2B3C2D3E2F3G1；最佳产酶培养基组成：蔗糖8.0 g/L，酵母膏11.0 g/L，磷酸二氢钾0.38 g/L，磷酸氢二钾0.38 g/L，氯化钙0.27 g/L，硝酸钾0.20 g/L，Tween-20 2.0 mL/L，玉米浆1.0 mL/L。最佳培养基组合不在正交试验组合内，3次重复验证试验结果表明：发酵液酶活性达(935.50±14.01)U/mL。方差分析结果(表3)显示：F蔗糖=48.723>F0.05(2，2)=9.28，蔗糖作用达显著水平，应严格控制其用量，其他因素未达显著水平。

表2 正交试验设计及直观分析结果Table 2 Arrangements of orthogonal experiments and results of visual analysis

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.4 酶催化黄芩苷转化初步试验

采用试验最优发酵产酶工艺，在未对酶催化转化体系优化条件下，发酵产酶催化转化72 h，黄芩苷转化率为31.20%±4.15%。下一步工作将对该酶催化黄芩苷转化最适温度、pH等酶学特性及料液比等转化体系影响因素进行深入研究，优化和提升黄芩苷转化率。

3 讨论

发酵时间优化试验中，发酵12 h之前发酵液未检测到β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活性，12 h之后酶活性逐渐增加，初步判断该酶合成类型为滞后合成型，推测存在分解代谢物阻遏作用，在解除分解代谢物阻遏方面，有待进一步深入研究。发酵12 h至42 h，发酵液酶活性显著增加，之后发酵液酶活性有所下降，原因可能与发酵液营养物质减少、菌体出现衰退衰亡、发酵液pH变化影响酶稳定性有关[7]。培养基初始pH值在6.0～7.5，发酵液产酶量较高且稳定；pH值为8.0时产酶量显著下降，表明碱性环境不利于JY24菌株产酶及酶活性发挥。培养基初始pH值与细胞生长繁殖、发酵产酶关系密切，对菌体细胞膜通透性有直接影响，进而影响细胞膜稳定性及产酶活力[8]。发酵温度35 ℃时，酶活性最高，进一步提高温度，酶活性则显著下降。通常较低温度可提高酶所对应mRNA稳定性，增加酶生物合成延续时间，提高产酶量；但温度太低易影响细胞生长繁殖，减缓代谢速度，降低产酶量和延长发酵周期[9]。

碳源优化试验中，不同碳源发酵液酶活性间均存在显著差异，蔗糖为碳源时，酶活性最高，表明蔗糖是影响发酵液产酶的关键因素。Ku等[5]对德氏乳杆菌Rh2产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的66种培养基进行筛选，基础培养基添加4%半乳糖产酶最佳。碳源优化时一般应考虑：菌株营养偏好选择；碳源对酶合成的代谢调节功能(诱导作用和分解代谢物阻遏作用)[10]；原料来源是否充裕、价格是否低廉、有否影响发酵工艺等因素[11]。氮源优化试验发现有机氮源产酶效果显著优于无机氮源，这与异养型微生物细胞生长、繁殖和产酶一般要求有机氮源一致[12]，可能无机氮源易使培养基pH降低致酶稳定性受影响有关。Chouiter等[1]报道树舌灵芝产β-D-葡萄糖醛酸苷酶最佳碳、氮源分别是阿拉伯胶和酵母膏，最佳氮源酵母膏与试验结果一致，最佳碳源则不同，可能与产酶菌株差异有关。

无机盐优化试验中，与对照相比，分别添加0.002 mol/L氯化钙、硝酸钾、硫酸锰、三氯化铁、硫酸铜和硫酸亚铁对发酵液酶活性均有显著促进作用。无机盐对细胞产酶有以下作用：构成细胞主要组成元素，构成酶分子组成元素，作为激活剂调节酶活性，起稳定氧化还原电位和渗透压作用。杨光等[13]研究表明Ca2+在0.5～10 mmol/L浓度范围内对β-葡萄糖醛酸苷酶具有激活作用；司磊[14]研究表明Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶促反应具有促进作用，而Fe2+有抑制作用，Zn2+低与高浓度作用不一。综上，Ca2+作用比较一致，对β-葡萄糖醛酸苷酶数量和活性表现促进作用，其它金属离子作用存在出入。表面活性剂优化试验表明Tween 20产酶效果最佳。表面活性剂可增加细胞膜通透性，利于胞外酶分泌，提高产酶量。杨耀刚等[15]]研究报道Tween能够增加底物与酶有效结合，提高纤维素酶热稳定性，且Tween 20强于Tween 80；β-D-葡萄糖醛酸苷酶主要来源于细菌和真菌，通常分2种：胞内酶和胞外酶。JY24菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活检测前期试验中，发现发酵液上清酶活性较高，而菌体破碎后粗酶液几乎检测不到酶活力，判断所产该酶为胞外酶，进而在培养基成分优化中，选择添加表面活性剂进行研究，以期增加细胞膜通透性和产酶量。目前，优化微生物菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的研究报道较少，已有树舌灵芝、毕赤酵母、产紫青霉和球毛壳菌产β-D-葡萄糖醛酸苷酶的工艺优化报道[3-4]，该酶活性范围1.09～2 356 U/mL，发酵产酶时间4～14 d，其结果与产酶菌株、酶促反应底物及菌株重组与否等差异有关。综上可知，试验菌株发酵1.75 d(42 h)，酶活性达935.50 U/mL，较优化前提高25.68倍，与上述研究相比，酶活性处于中等水平，发酵产酶时间缩短2.25～12.25 d。

4 结论

鸡源饲用枯草芽孢杆菌JY24菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶最佳发酵工艺：产酶条件：发酵时间42 h，转速240 r/min，装液量10%，培养基初始pH 7.0，发酵温度35 ℃，接种量4%；产酶培养基组成：蔗糖8.0 g/L，酵母膏11.0 g/L，磷酸二氢钾0.38 g/L，磷酸氢二钾0.38 g/L，氯化钙0.27 g/L，硝酸钾0.20 g/L，Tween-20 2.0 mL/L，玉米浆1.0 mL/L，黄芩苷1.5 g/L。在最佳发酵工艺条件下，鸡源饲用枯草芽孢杆菌JY24菌株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶酶活性达935.50 U/mL，较优化前提高25.68倍，发酵产酶时间缩短2.25～12.25 d，酶催化初步研究表明黄芩苷转化率为31.20%。