β-葡萄糖苷酶固体发酵培养条件的优化

王振丽，李书华，王婷婷

（河南质量工程职业学院，河南平顶山 467000）

大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是一类重要的生理活性物质，如防治心脑血管疾病、预防骨质疏松症、改善妇女更年期综合症等。大豆异黄酮主要有两种存在形式—游离型的苷元（Aglycon）和结合型的糖苷（Glycosides）两类，从大豆中提取的大豆异黄酮中游离的苷元占总量的2%～3%，糖苷占总量的97%～98%，而糖苷形式的大豆异黄酮不具有最佳的生理活性状态，很难被人体直接吸收，必须要经过β-葡萄糖苷酶作用，生成苷元形式才易被人体吸收[1-2]。充分发挥菌株的产酶性能还需提供最佳产酶条件[3-5]，因此，β-葡萄糖苷酶的固体发酵培养条件的优化研究十分重要。

1 材料与方法

1.1 菌种与固体培养基

米曲霉3042，由辽宁省微生物科学研究院菌种保藏中心提供。黑豆：麸皮为2∶3、培养基中加水量与固体物料比为1.5∶1，KH2PO40.1%、MgSO40.1%、(NH4)2SO40.5%、水杨苷0.01%，121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器

高压灭菌锅、电热恒温培养箱、7230型分光光度计、恒温水浴锅（北京）、低温高速离心机（Sigma）、超声波细胞粉碎机。

1.3 实验方法

1.3.1 产酶固体发酵

将培养42 h后的液体种子接入产酶固体发酵培养基中，接入量为10%，28 ℃恒温培养，当菌体孢子大量长出时取出，在研钵中研磨至小碎片后称取5 g加入50 mL蒸馏水，室温浸泡提取4 h，用纱布过滤，滤液于4 ℃离心后取上清液，测其β-葡萄糖苷酶的酶活力，测定时取相应的0.05 mol·L-1pH为4.5的柠檬酸缓冲液稀释。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶活力的测定

取3支10 mL洗净干燥的具塞刻度试管，编号后每支加1 mL的0.5%水杨苷柠檬酸缓冲液，1号管加1mL的DNS溶液作为空白对照，将3支试管同时在50 ℃水浴中预热5～10 min，加酶液0.5 mL，摇匀，置沸水浴5 min，冷却后用蒸馏水定容至10 mL，混匀，于540 nm处测A值。将每小时分解底物产生1 μmol还原糖（葡萄糖计）所需的酶量定义为1个酶活力单位u/mL。

2 结果分析

2.1 产酶的最适温度

如图1所示，当温度达到32 ℃时，酶活力达到最高，此后随着温度升高酶活力下降，说明菌株产酶的最适培养温度为32 ℃。

图1 温度对产酶的影响

2.2 产酶发酵的最适初始pH值

由图2可知，pH在4.0时菌株产酶能力很低，当pH达到6.0时产酶能力最高，当pH为7.0时酶活力开始下降，表明该菌株在发酵初始pH为5.5～7时产酶能力均相对较强，该菌的最适产酶pH为6.0。

图2 pH对产酶的影响

2.3 发酵周期

由图3可知，菌株在最佳发酵条件下进行培养，随着发酵时间的延长产酶能力逐渐提高，当发酵培养到84 h时，出现产酶最高峰，酶活力达1 345.63 u·mL-1，随后随着发酵培养时间的延长产酶能力逐渐下降，其最佳发酵培养时间为84 h。

3 结论与讨论

（1）在最适固体培养基的基础上，优化米曲霉3042产β-葡萄糖苷酶的最佳培养条件，经过研究发现适宜培养条件为发酵培养温度为32 ℃，发酵初始pH6.0，发酵培养时间为84 h。

（2）大豆异黄酮苷元有利于动物的吸收利用，在一定条件下，大豆异黄酮苷元含量在β-葡萄糖苷酶作用下显著增加。因此，提高β-葡萄糖苷酶的酶活力，对利用其转化结合型大豆异黄酮的研究具有重要的意义。