活血软坚通络方对大鼠冠脉微血管血栓及内皮损伤因子水平的影响

张 萌 李 明 张 莉 张 明 苗 鑫 李元民

山东第一医科大学第二附属医院，山东泰安 271000

微血管病变的研究随科技发展不断深入，心脏作为有节律的泵血器官，其微血管的研究较其他器官更加复杂。冠脉微血管功能障碍是微血栓形成、微血管痉挛、内皮炎症、肌源性收缩等多方面因素导致的［1］。中医认为病变部位在心之络脉，吴以岭等人［2］提出“孙络-微血管”概念，总结中医病机：心气亏虚，心络脉瘀滞不通，采用通络活血治疗取得显著疗效。本研究采用向大鼠左心室注射月桂酸钠建立冠脉微血管血栓及内皮损伤动物模型，给予自拟活血软坚中药进行干预，通过观察大鼠心肌病理损伤修复、微血管血栓及血清中内皮损伤相关的检测指标前列腺素I2（PGI2）、血栓素A2（TXA2）变化情况，探讨中药方对冠状动脉微血管病变的相关作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验动物为济南朋悦实验动物繁育有限公司提供的Wistar 雄性大鼠，7 周龄，体重（221 ± 30）g，动物许可证号：SCXK（鲁）20190003。饲养于山东第一医科大学实验动物中心病理动物室，观察生命体征1周后实验开始。

1.2 实验药品和试剂

1.2.1 观察药物 活血软坚中药由黄芪15 g、川芎5 g、地龙5 g、桃仁5 g、牡蛎15 g、荔枝核10 g、土鳖虫5 g、泽泻5 g 等组成。本方以中医经典方补阳还五汤加减而成，中药饮片购于山东第一医科大学第二附属医院药剂科，由药剂科加工成4 g/mL的浓缩剂。

1.2.2 对照西药 尼可地尔片，规格5 mg，天方药业有限公司，国药准字H41024517。

1.2.3 ELISA 试剂盒（上海酶免生物科技有限公司），实验用月桂酸钠粉剂（十二酸钠）（武汉富鑫远科技有限公司），注射用戊巴比妥钠0.1 g（上海国药有限公司），肝素钠注射液2 mL：12 500 iu（昆明积大制药有限公司），注射用青霉素钠粉剂0.48 g（80万单位）（山东鲁抗医药股份有限公司）。

1.3 实验器材

1.3.1 实验器械 3K30 高速离心机（德国Sigma公司），超低温－80 ℃冰箱（中科美菱低温科技有限公司），小动物呼吸机（ALC-V8型动物呼吸机，江苏赛昂斯生物科技有限公司），电子秤台秤（北京京衡伟业科技有限公司），灌胃针（规格：16 号，8 cm，北京中昊万通科技有限公司），高精度天平（梅特勒-托利多公司，AB265-S），光学显微镜及图像观察系统。

1.3.2 其他器械及辅料 气管插管套管，眼科直剪，蚊氏止血钳，巾钳，开胸器，大鼠实验解剖台，镊子，手术刀片，弯剪，直剪，防凝管，缝针，量筒，小针刀，皮拉钩，吸引器，0.1 mL安全注射器，20 mL注射器，无影灯等。棉签、棉球、无菌纱布、绷带、胶布、5%碘伏、75%酒精、乙醇、骨蜡、0.9%生理盐水、蒸馏水（山东第一医科大学药理实验室提供）。

1.4 造模方法

根据冠状动脉微血管病变动物建模方法评估［3-4］选用向左心室注射月桂酸钠法造模，造模处理过程［5］：选择造模组大鼠逐个称重并记录，根据体重给予戊巴比妥钠（35 mg·kg－1）麻醉，麻醉成功后，动物解剖台固定四肢，剃毛备皮后碘伏3次消毒，选择大鼠颈部正中偏下切开皮肤，注意保护动脉，逐层分离直至暴露大鼠气管，给予气管插管操作，检测气管插管成功后，迅速连接小动物呼吸机通气。待呼吸节奏平稳后，选择大鼠左胸部第2～3肋间，再次消毒，沿胸骨左缘纵向切开皮肤，钝性分离肌肉，大范围暴露左侧肋骨，利用咬骨钳精准剪断第2、3、4、5 肋，充分暴露大鼠心脏、主动脉，保护心脏附近走行神经助手观察主动脉升部以及弓部，施术者用小动物开胸器将大鼠胸腔左右扩开并固定，暴露心尖部，将微量注射器沿心尖部刺入左心室，迅速打入已配置的月桂酸钠SL（1 mg·kg－1），注射完成后助手迅速夹住主动脉升部与弓部连接处10 s，间断夹持，使SL沿主动脉起始部流入冠状动脉。完成SL注射操作后将心脏放回，观察心脏搏动情况，待搏动平稳后，胸腔注射0.1 mL青霉素再逐层缝合。待呼吸心跳平稳10 min后拔除气管插管。术后3天常规给予青霉素40万单位腹腔注射预防感染，动物清醒后入笼饲养。假手术组手术方式与造模组相同，但不注入月桂酸钠。术后3 d连续肌肉注射青霉素预防感染。

1.5 分组及给药

将60 只健康Wistar 大鼠按随机数字表法随机抽出假手术组15 只，余为造模组45 只。造模组行SL注入左心室造模，非造模组行假手术。将已造模成功的大鼠利用随机数字表法再随机进行分组。尼可地尔组、中药组在造模成功后第2 天开始药物干预，分别给予尼可地尔1.5 mg·（kg·d）－1、活血软坚中药15 g·（kg·d）－1灌胃，假手术组、模型组给予同等剂量蒸馏水灌胃，每日1次；实验剂量采用大鼠的临床等效剂量换算而成。

于造模后第28天，将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，各组大鼠腹主动脉取血，并处死取心脏，动脉血立即离心（3600 r·min－1，10 min），分离血清，分装密封，保存备用。心脏另行切片、固定，保存备用。实验整个过程及动物处死均符合实验动物伦理标准。

1.6 实验指标及指标测定

1.6.1 心肌苏木素-伊红（HE）染色 将心脏沿纵轴切开，取需要染色心肌标本，各浓度酒精反复脱水，二甲苯浸泡透明，浸蜡包埋，自动切片机切片，脱蜡并心肌苏木素-伊红染色，再行各梯度酒精脱水、透明固封［6］。

1.6.2 将所取标本沿心脏长轴切开，取2 mm厚心肌切块，甲醛固定并染色，在光镜下以视野（×100）随机观察直径≤100 μm的冠脉微血管［5］，统计微血栓堵塞的血管数占所观察微血管百分率，评估微血管阻塞情况。

目前，椎弓根螺钉已广泛应用脊柱骨折、椎间盘突出症、椎管狭窄及脊柱肿瘤中。椎弓根置钉方法有很多，而术中导航为最准确的[1]，但导航系统价格高昂，难以短期内在更大范围内应用。基层医师因条件限制，术中往往凭经验、手感行椎弓根螺钉置入，其位置常常很难控制，甚至会将椎弓根穿破，其发生率为20～30%。我们在基层医院常常可以碰到椎弓根钉植入失当或误置，引起骨折复位不佳、固定不稳，甚至出现了许多诸如椎弓根螺钉穿破椎弓根、椎体，损伤血管、脊髓、神经根等并发症[2]。这些并发症的发生不仅与手术者水平有关，还与椎弓根解剖结构个体差异有关。

1.6.3 采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清中PGI2、TXA2的水平。严格按照试剂盒标注方法进行检测。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 模型建立情况

采用向大鼠左心室注射月桂酸钠法致大鼠冠状动脉微血管阻塞及内皮功能损伤，共造模45只。造模过程中死亡2 只，存活43 只，假手术组手术死亡1 只。造模72 h 后分别抽取假手术组和造模组各2 只行心脏病理切片检查及微血管观察，结果显示假手术组大鼠冠脉微血管未见明显阻塞，心肌组织未见明显病理改变；造模组大鼠冠脉微血管见不同程度阻塞，血管腔紧缩狭窄；阻塞微血管附近心肌细胞核固缩，染色质聚集，细胞间紧密连接断裂增宽。提示大鼠冠脉微血管阻塞模型造模成功。见图1。

图1 完成造模操作后72 h心肌病理切片（HE × 100）

将造模成功的41只大鼠随机分为三组，模型组14 只，中药组 14 只，尼可地尔组 13 只，以假手术组（12只）为对照组。

2.2 28天后各组大鼠心肌病理切片观察

假手术组切片显示：心肌冠脉微血管内镜下未见明显栓塞，所观察微血管范围的心肌组织未见明显缺血或纤维化等病理改变。模型组：冠脉微血管内见粉红色由血小板、纤维素和红细胞等组成的微血栓形成，血管周围心肌细胞核聚集，心肌纤维断裂，排列紊乱，周围有纤维组织增生。尼可地尔组：所观察微血管病理变化较模型组相似，对比之后发现微血管阻塞数目、微血管内血栓阻塞程度及所观察微血管范围内相关心肌损伤、心肌纤维增生等病理变化较模型组变化明显。中药组：病理与模型组相似，在微血栓栓塞及心肌损伤方面有明显改善，但较尼可地尔组相比血管阻塞改善不明显。见图2。

图2 28天后各组大鼠心肌病理切片观察（HE × 100）

2.3 28天后各组大鼠冠状动脉微血管血栓阻塞情况观察及数目

光镜下观察假手术组未见有明显符合条件的微血管。模型组：视野下栓塞微血管数目较多，且大部分血管阻塞≥50%。尼可地尔组：视野下栓塞微血管数目及血管阻塞情况较模型组有明显改善。中药组：视野下栓塞微血管数目及血管阻塞情况较模型组有改善，但弱于尼可地尔组。见图3。

图3 28天后各组大鼠冠状动脉微血管血栓阻塞情况观察（HE × 100）

表1 28天后四组大鼠微血栓堵塞血管率（，%）

表1 28天后四组大鼠微血栓堵塞血管率（，%）

注：与模型组比较，aP ＜ 0.01；与模型组比较，bP ＜ 0.05。

n 12 14 14 13组别假手术组模型组尼可地尔组中药组微血栓阻塞血管率0 35.84±2.04 19.03±1.18a 20.01±1.35b 1435.451＜0.001 F P

2.4 大鼠血清PGI2及TXA2水平

与假手术组比较，模型组大鼠血清PGI2明显减少（P＜ 0.01），TXA2明显升高（P＜ 0.01）；与模型组比较，中药组大鼠血清PGI2明显升高（P＜ 0.01），TXA2明显减少（P＜ 0.01）；与尼可地尔组比较，中药组血清PGI2及TXA2未见明显改变（P＞ 0.05）。结果见表2。

表2 28天后各组大鼠血清PGI2、TXA2水平（ ng/L）

表2 28天后各组大鼠血清PGI2、TXA2水平（ ng/L）

注：与假手术组比较aP ＜ 0.01；与模型组比较：bP ＜ 0.01。

组别假手术组模型组尼可地尔组中药组TXA2 6.91±0.30 16.28±0.71a 9.35±0.58b 9.79±0.52b 632.701＜0.001 n 12 14 14 13 F P PGI2 35.38±1.47 22.02±1.06a 47.83±1.07 47.00±0.93b 1420.662＜0.001

3 讨 论

冠状动脉疾病主要涉及冠脉通道动脉及冠脉微血管，冠脉通道动脉的狭窄已被PCI 有效解决，但PCI 术后或未曾手术而造成的无复流、慢血流现象仍然困扰着研究者，因此冠脉微血管病变也就成为研究的重点。冠脉微血管病变的多种临床表现、不能被广泛认可的治疗方案以及治疗效果的不确定性源于对其发病机理认识的不足和现代药物发挥临床作用的局限性。冠状动脉微血管病变的流行病学研究提示冠脉小动脉的复杂多样的调节机制存在空间分布的异质性［7］。即使在正常冠脉血流情况下，微血管舒张/收缩在空间分布中也是不一致的，这种现象表明冠脉微血管的调节存在广泛的、复杂的、与代谢密切相关的机制。微血管栓塞被认为是冠脉微血管慢血流的主要原因［8］。除去手术人为因素造成血栓阻塞外，内皮炎症反应是引起微血管栓塞的主要因素［9-10］，PGI2和TAX2作为参与微血管血栓形成的炎症因子，可代表内皮炎症反应的轻重。有研究表明，冠脉微血管病变，PGI2减少，TAX2升高［11］。

在实验造模选择方面，因冠脉微血管病变病理机制的复杂性，现在尚没有一个能够代表各种病理机制的理想动物模型。据各种造模的报道，对不同的病理机制在模型选择上亦有一定倾向性，有学者［3］选择自制微颗粒或自体血栓作为血管阻塞模型，但无法模拟内皮炎症反应的病理过程。本实验选择月桂酸钠造模法，据沈成兴等人［4］实验表明，注射月桂酸钠可引起冠脉微血管内皮炎症反应，造成血管血栓阻塞。注射月桂酸钠1 h后即引起的微血栓，72 h 后达到稳定状态，故选择造模完成72 h 后行心肌病理检查。到目前为止在临床治疗过程中，仍然没有一种确定的药物被证实对冠脉微血管病变普遍有效，但部分药物在冠脉微血管病变的某些方面已确定疗效，有研究报道，开放钾离子通道药尼可地尔能改善血管内皮功能，扩张微血管，调节纤溶活性，但并没有减少心肌梗死面积［12-13］。

中医历代文献中并没有微血管的相关概念，但根据临床症状记载散见于“心痛”、“胸痹”、“虚里痛”等中，张仲景首开络脉治疗先河，应用旋复花汤、大黄蟅虫丸治疗肺络、胞宫络病变，及至清朝叶天士重用虫类药物治疗络脉疾病，为后世应用虫类药物治疗积累了丰富的经验。自吴以岭［2］提出络病“孙络-微血管”病理概念，明确冠脉微血管在中医上属于心之络脉，中医治疗络病积累了丰富的经验，总结临床主要治疗经验，归纳心络脉病变的主要病机为：血瘀、痰结、络积［14-15］。吴以岭等人［2］应用活血通络法进行治疗取得良好疗效。有学者报道，应用活血通络的补阳还五汤可改善冠心病PCI术后症状［16］。刘琪等人［17］报道运用软坚散结法进行治疗效果明显。本次实验所选活血软坚中药是在补阳还五汤基础上结合吴以岭通心络的虫类药物用药经验加入牡蛎、荔枝核软坚散结药物组成。其中黄芪为君药补养元气，川芎、土鳖虫为臣药活血散瘀，桃仁、当归、牡蛎、荔枝核为佐药，地龙为使药，引诸药入络脉而发挥通络散结作用。诸药合用共同作用于心之络脉，活血瘀、逐痰凝、通络脉。

本研究发现，用药28 d 后，活血软坚中药可减轻微血管栓塞及增加PGI2，减少TAX2，在改善微血管血流及减轻心肌损伤方面有明确的作用。与尼可地尔组比较，活血软坚中药未见明显优势，其可能原因为：①中药组对于冠脉微血管栓塞及内皮损伤发挥作用可能是多维度的，与尼可地尔单一机制不同，本次选取微血管栓塞及损伤因子PGI2、TXA2尚不足以全面反映中药方的作用机制；②中药组可能需要更长时间才能改善冠脉微血管病变。

另外，本研究在对心肌进行病理检查时发现利用月桂酸钠造模在同一只大鼠冠脉微血管的不同部位，血管损伤亦有很大的区别。在损伤微血管附近的心肌病理改变也呈现出不同程度的差异性，有的以血管炎症反应为主，有的以心肌坏死纤维化为主。上述两点亦反映了在冠状动脉微血管病变机制上的复杂性。与尼可地尔主要改善微血管血栓阻塞作用不同，中药方对冠脉微血管病变的血栓、心肌损伤等诸方面均有作用，这也进一步证实中药方多靶点、多层次作用机制。以本次研究为基础，后期我们会重点研究造成冠脉微血管病变多种机制之间的相关联系，以期待能阐明某种条件下的确定性的病变机理及治疗方案。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突