富氢水缓解5-FU诱导的大鼠口腔粘膜溃疡

张单雅 薛俊莉 刘伯言 陶鸽如 石运芝 秦树存

山东第一医科大学（山东省医学科学院）1.口腔医学院；2.生命科学研究中心，山东泰安 271000

化疗药物引起的口腔粘膜溃疡（oral mucosal ulcer，OMU）是一种常见的化疗不良反应［1］。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是一种抗代谢药物，被用于乳腺、头颈部和消化道等多种肿瘤的治疗，以5-FU为基础治疗手段的患者中约有40%会出现OMU，临床上以对症治疗为主，尚无高效稳定的治疗措施［2］。氢分子（molecular hydrogen，H2）是一类新型细胞抗氧化剂，其抗氧化、抗炎、抗凋亡的生理医学效应已在超过100种疾病模型中证实［3-4］。研究表明，氢分子在多种肿瘤放化疗中起到明显的减毒增效作用［5-6］。深入探讨氢分子对化疗药物5-氟尿嘧啶引起OMU局部组织学、免疫学指标的影响等，将为临床应用富氢水来改善放化疗副作用，提高患者生存质量提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与取材

28 只健康雄性SD 大鼠，体重180 ～ 200 g（山东鲁抗实验动物中心提供），随机分为5组。NaOH 颗粒 + 富氢水（A-H）组（n=6）：连续2 日给予实验大鼠 5-FU（0.05 mg/g，Sigma-Aldrich #F6627）腹腔注射［7-8］，第3 日用 2 ～ 3 粒 NaOH 颗粒，放置于左侧颊部粘膜，放置时间约2 min后取出，第5日开始，晚间约19∶00 从密封桶中接富氢水（泰山岳溪泉饮有限公司灌制）至饮水瓶饲喂大鼠，早9∶00开始停水，保证大鼠饮用到氢气浓度较高的富氢水；NaOH 颗粒+普通纯净水（A-N）组（n=6）：造模方法同A-H组，给予实验大鼠普通纯净水，饲喂时间与富氢水组相同；20%乙酸+富氢水（B-H）组（n=6）：连续2日给予实验大鼠5-FU 腹腔注射，第3 日将15 μL 20%乙酸注射于左侧颊部粘膜下层，进针角度约20°，第5 日开始，给大鼠饲喂富氢水，方法同A-H 组；20%乙酸+普通纯净水（B-N）组（n=6）：造模方法同BH组，给予实验大鼠普通纯净水，饲喂时间与富氢水组相同；健康对照（C）组（n=4），给予实验大鼠普通纯净水，饲喂时间同其他实验组。使用50 μm玻璃针状氢传感器（Unisense，Aarhus，丹麦）测定灌装富氢水中氢气的含量，接取的富氢水在5 h 内可保证氢气浓度≥1 ppm。

实验进行中统计存活率。第10日，采用戊巴比妥钠将大鼠麻醉，观察口腔粘膜损伤情况，拍照记录，并使用Image J软件测量溃疡面积。采集下腔静脉血清，-80 ℃冰箱保存备用。将大鼠安乐死后，切取大鼠左侧颊囊溃疡处组织，4%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡切片（5 μm），用于HE染色和免疫组织化学分析。本实验获得山东第一医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA检测

采用生物素双抗体夹心ELISA 法测定标本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、IL-6、IL-1β 的水平，检测试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供，操作步骤按说明书进行，终止反应后用酶标仪（infinite F200）即刻测量450 nm波长的吸光度值。根据标准品的浓度及对应吸光度值计算出标准曲线的直线回归方程，然后计算出样品浓度。

1.3 免疫组化染色

石蜡切片经脱蜡、水化后，放入枸橼酸缓冲液内，微波抗原修复20 min，自然冷却至室温后双蒸水冲洗，滴加3%H2O2室温孵育5 min，PBS冲洗。分别滴加兔抗TNF-α（1∶200，MyBiosource，MBS820357）、兔抗IL-6（1∶200，MBS2564633）和兔抗诱导型一氧化氮合酶（iNOS，1∶200，MBS3000624），37 ℃孵育2 h，PBS 冲洗。滴加羊抗兔IgG/HRP 聚合物，室温孵育 20 min，PBS 冲洗。DAB 显色，自来水冲洗，苏木精复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照切片以PBS 代替一抗。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 组织病理分析

肉眼观察，与对照组相比，基于5-FU 与20%乙酸或NaOH 颗粒均可造成口腔颊部粘膜炎性损伤，表现为颊部粘膜损伤区形成直径约3 ～8 mm 的圆形或椭圆形溃疡，表面有厚约1 ～3 mm的灰白色假膜覆盖，周围黏膜充血、肿胀甚至出血（图1A）。撕脱白膜后，可见火山口样溃疡（图1B）。

图1 大鼠口腔溃疡模型，20%乙酸模型组，颊粘膜表面覆盖一层可撕脱白膜（A），撕下可见粘膜红肿破溃（B）

显微镜下观察，正常大鼠颊粘膜表面被覆角化的复层鳞状上皮，固有层为致密结缔组织，富含血管，上皮钉突较短（图2A，2B）。NaOH 颗粒模型组表层可见大量的坏死、出血和渗出，其下组织中含有大量中性粒细胞和增生的成纤维细胞（图2C，2D）。乙酸模型组也表现为粘膜的坏死、出血和渗出，甚至累及肌层的表面（图2E），部分饮用富氢水组的粘膜损伤较轻微，表现为上皮钉突反应性增生和固有层炎性细胞浸润（图2F）。

图2 大鼠口腔颊粘膜病理学观察

检测结果显示，饮用富氢水可提高实验组大鼠存活率（P＜ 0.05）（图3A）。NaOH 及乙酸造模组的2 组大鼠，在第11 日时的存活率为66%（4/6），而饮用富氢水的2 组大鼠没有发生死亡，存活率为100%（6/6）。对于溃疡面积，NaOH 颗粒制造的溃疡，损伤面积大于注射20%乙酸造成的溃疡损伤（图3B）。NaOH 造模的实验组中，饮用富氢水组的溃疡面积小于模型组，但差异无统计学意义；乙酸造模的实验组中，富氢水组和模型组溃疡面积相近。

图3 富氢水抑制大鼠口腔溃疡动物实验，饮用富氢水可提高实验组大鼠存活率（A），而溃疡组织假膜面积无明显差异（B）

2.2 大鼠血清中ELISA检测结果

对照组大鼠血清中炎性细胞因子的含量处于正常水平。模型组大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β含量均高于对照组，而富氢水组较模型组均有降低的趋势，但仅B-N 组IL-1β 与对照组比较差异有统计学意义，余差异均无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠血清中炎性细胞因子水平（pg/mL）

2.3 颊粘膜免疫组化结果

显微镜下，免疫阳性产物呈棕黄色，阴性对照不着色。TNF-α在健康对照组中的表达最弱，阳性着色主要见于各实验组大鼠上皮细胞和炎性间质中（图4A）。以乙酸造模的实验组为例，B-N组炎性细胞高表达TNF-α（图4B），B-H组仅上皮棘层细胞表达TNF-α，固有层着色浅（图4C）；IL-6阳性着色部位与表达模式与TNF-α相似（图4D ～4F）。iNOS在实验组颊粘膜中的阳性表达均较少（图4G ～4I）。以上结果说明，饮用富氢水有效降低了大鼠颊部粘膜的炎症水平。

图4 大鼠颊粘膜免疫组织化学染色

3 讨 论

化疗药物引起的OMU 严重影响了化疗患者的生活质量［9］。本研究基于大鼠OMU模型，探究了氢分子对化疗药物诱导的OMU 的缓解作用。结果显示，饮用富氢水可有效提高乙酸损伤诱导OMU大鼠的存活率（由66%提升至100%），降低大鼠系统性炎症与颊部粘膜的炎症，具有明显的OMU 缓解作用，为进一步应用氢分子作为口腔炎症疾病的辅助治疗手段提供了基础研究数据。

OMU 现有的治疗方法以减轻疼痛、促进溃疡愈合和延长复发间歇期为目的，如补充缺少的微量元素、改善微循环、调节内分泌、使用免疫增强药等［7，10-12］。但这些药物尚具有局部用药不便、有效成分及副反应不明确等缺陷。氢分子作为一种安全、容易获取的新型抗氧化剂，通过有选择性地降低羟自由基（·OH）和亚硝酸阴离子（ONOO－），保护细胞免受氧化应激损伤［13］。近年来，氢分子的选择性抗氧化作用逐渐被人们所认识，并因其高度的安全性，被认为是具有巨大潜力的“稳态平衡剂”［14］。氢分子对皮肤损伤、口腔上颚创伤、化疗引起的器官损伤均具有显著的保护作用［15-17］。研究表明，吸入1%的氢气或饮用富氢水能够减轻小鼠由顺铂引起的肾脏损伤，缓解肾脏的细胞凋亡，血清肌酐和尿素氮水平均有所下降［18］。Meng等［19］证实，在顺铂诱导的大鼠卵巢损伤模型中，注射富氢生理盐水能够促进卵泡发育趋向规律，减轻各级卵泡皮层的损伤，具有明显的卵巢保护作用。此外，一项包含152 例接受mFOLFOX6 化疗的结直肠癌患者的随机单盲临床试验，发现饮用富氢水对mFOLFOX6引起的肝损伤具有保护作用［20］。

我们的研究中，富氢水组的大鼠系统性炎性因子水平与颊粘膜局部的炎症因子表达均有所下降，这可能与氢分子抑制氧化应激对黏膜的直接损伤和NF-κB等转录因子的激活，从而减少系统性TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS等促炎因子的表达有关［21］。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突