口腔鳞癌Survivin表达及其在血管生成中的作用

李腾宇 张 霞 于肖鹏 李晓光 王西冉 王延秀 刘焕燕

泰安市中心医院1.口腔科；2.疼痛科，山东泰安 271000

口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）严重影响和威胁人类的健康和生命，其生长需有新生的血管提供营养，而血管的生成则需要多种因素的参与［1］。凋亡抑制因子生存素（Survivin）与肿瘤转移、增殖关系密切，几乎表达于人类所有肿瘤组织［2］，促进肿瘤耐药和血管生成［3-4］。本研究采用免疫组化方法，检测OSCC 组织Survivin、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的表达情况，测定其微血管密度值（microvascular density，MVD），探讨 Survivin 与 COX-2、VEGF 及OSCC 血管生成的关系。

1 材料和方法

1.1 临床资料及切片制备

OSCC 标本共 106 例，来自 2007 至 2017 年我院颌面外科病房手术切除组织，患者年龄34～78 岁，平均（60.6 ± 7.5）岁，其中女性患者41 例，男性患者65 例。根据术后病理检查诊断的结果，判断颌颈部的淋巴结有无出现转移。选取的106 例病例手术前均未进行化学治疗或放射治疗，临床分期按照TNM 国际统一分期方法（UICC）分组，其中Ⅰ期 14 例，Ⅱ期 29 例，Ⅲ期 38 例，Ⅳ期 25 例；组织病理学分级为：1 级 33 例，2 级 51 例，3 级 22 例；具体肿瘤部位为：舌癌 41 例，牙龈癌 30 例，颊癌 13 例，硬腭癌8 例，口底癌14 例。一抗为抗Survivin、COX-2、VEGF、CD34 单克隆抗体，切片进行免疫组化染色及HE染色。

1.2 免疫组织化学染色

DAB 试剂由 Sigma 公司提供，Survivin、COX-2、VEGF、CD34 单克隆抗体由博士德公司（武汉）提供。SABC免疫组化操作方法按照说明书进行。用已经过检测明确的Survivin、VEGF、COX-2、CD34为阳性的乳腺癌切片作为阳性对照。一抗用PBS 替代作为阴性对照，DAB显色，苏木精复染。

1.3 Survivin、COX-2、VEGF的判断标准

癌细胞的细胞质内含有棕褐色颗粒即视为阳性染色。每张切片有10%以上的癌细胞表现为弱、中等强度着色［5］，即判断为染色阳性，否则判为染色阴性。

1.4 CD34染色阳性细胞标准及MVD判断标准

微小血管或毛细血管内皮细胞内有棕黄色颗粒为 CD34 染色阳性细胞。按照 Weidner［6］的标准，出现单个的CD34 阳性内皮细胞或者细胞群，计数为一个血管。200倍的显微镜下，每个组织切片选3个血管量最多的视野，进行统计计数。每个组织标本选5 个视野，分别计数，计算其平均值，即为此组织标本的MVD。

1.5 统计学处理

采用SPSS22.0统计软件分析数据，计量数据用均数 ± 标准差（）表示，组间比较采用t检验；分类数据用频数表示，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 Survivin、COX-2、VEGF的表达及CD34染色结果

106 例OSCC 组织中，有69.81%（74 例）表达Survivin，61.32%（65例）表达VEGF，71.70%（76例）表达COX-2。Survivin、COX-2、VEGF 阳性染色主要在肿瘤细胞的胞膜或胞浆，见图1A～C。CD34阳性染色结果见图1D。

图1 口腔鳞癌Survivin、COX-2、VEGF的表达及CD34染色结果

2.2 OSCC 组 织 Survivin 表 达 与 COX-2、VEGF、MVD的关系

在Survivin表达阳性组中，COX-2及VEGF的阳性率较Survivin阴性表达组增高明显（P＜0.05），MVD值较阴性表达组明显升高（P＜0.01）。见表1～3。

表1 OSCC组织Survivin表达与COX-2的关系

Survivin 和COX-2表达均为阳性的OSCC 组织，MVD明显高于表达均为阴性者，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），见表4；Survivin 和VEGF 表达均为阳性的OSCC组织MVD明显高于表达均为阴性者，差异具有统计学意义（P＜ 0.01），见表5。

表4 Survivin、COX-2表达均为阳性与均为阴性OSCC组织MVD的比较结果

表5 Survivin、VEGF表达均为阳性与均为阴性OSCC组织MVD的比较结果

3 讨 论

Survivin 具有促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡的作用，对抗诱导肿瘤细胞进行凋亡的抗癌药物［4］。肿瘤大于1～2 mm时，需要新生的血管形成供应营养［7］。MVD 值可以量化血管形成的数量。CD34 可以标记血管内皮细胞，以此计算肿瘤组织中的MVD值，血管密度也是反映肿瘤浸润增殖和生长转移能力的指标［8］。

表2 OSCC组织Survivin表达与VEGF的关系

表3 OSCC组织Survivin表达与MVD的关系

既往有大量基础实验及临床标本实验显示，Survivin 基因可以通过上行调节VEGF 和COX-2 基因的表达，促进肿瘤血管的生长［9-11］。COX-2是环氧化酶（又称环氧酶等）的诱导型酶，可以调控前列腺素类的化合物产生，是其重要的限速酶，多种刺激因素可刺激其上调，如生长因子、细胞因子、内皮素、癌基因等。多项实验提示COX-2拥有促肿瘤血管形成功能［12-13］。VEGF是最强促血管生成因子［14］，有多项研究显示，在膀胱癌和口腔鳞癌等组织中，Survivin和COX-2、VEGF蛋白的表达密切相关［15-16］。在已有的多个血管内皮细胞增殖的实验中，0′Connor［17］发 现 VEGF 诱 导 Survivin 表 达 升 高 近16 倍，说明促进血管形成过程中，Survivin 与VEGF拥有协同作用。Mesri 等［14］将 Survivin-ASODN 导入内皮细胞，发现VEGF 的抗凋亡作用也同时受到压制，血管网出现退化，提示VEGF 可能是通过上调Survivin 的表达发挥其抗凋亡的功能，从而促进血管的生成。有研究发现，Survivin 可以抑制肝癌细胞的凋亡并促进肿瘤血管生成，通过上调VEGF 蛋白的表达，从而促进肝癌的发生和发展［18］。

本实验结果表明，在OSCC 组织细胞中，Survivin 与 COX-2、VEGF 表 达 明 显 相 关 ，说 明Survivin 可能是通过上行调节COX-2、VEGF 表达，进而促进肿瘤的血管形成。Survivin、COX-2、VEGF表达与口腔癌MVD值均呈明显的正相关，提示在此过程中，三者相互协同促进血管形成，具体机制有待进一步探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突