ETF在乳腺癌组织中的表达及对乳腺癌细胞增殖的影响

赵璐，孙茂伟，邹鹏∗

（1.沈阳医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁 沈阳110034；2.沈阳市积水潭医院普外科）

乳腺癌是导致女性癌症患者死亡的第二大因素，仅次于肺癌［1］。近年，其发病率持续上升，是威胁女性健康的恶性肿瘤之一［2］。目前，手术切除是治疗乳腺癌的首选方案，随着医学技术的不断发展，结合化疗、内分泌治疗、放射治疗、分子靶向治疗等方法能够提高患者的生存质量和生存期［3－4］。但是由于乳腺癌本身在组织水平、治疗反应、远端转移位点等方面都存在极高异质性，即使相同的临床病例特征患者，也会出现不同的治疗反应和临床预后，因此仅从临床病例特征对患者进行诊断和预后较为片面，新的诊断标记物的发现势在必得，可为乳腺癌诊断、预后以及治疗提供依据［5］。转录因子ETF（TEA domain family member 2或TEAD2）属于TEF家族，其N－末端含有一个由72个氨基酸组成的TEA DNA结构域［6］。研究表明该家族成员能够参与多种信号通路，在肿瘤形成、转移、代谢、免疫和耐药过程中起重要作用［7］。赵璐等［8］研究发现ETF通过MAPK－ERK信号通路促进肝癌细胞的恶性增殖。Sebastian等［9］在胶原单层培养基上培养C57BL／6N小鼠肝细胞72 h后，发现与细胞周期相关的基因表达上调，其中包括ETF，能够增强细胞的基础增殖频率。ETF通过其C端反式激活结构域与YAP／TAZ的N端 相 互 作 用，形 成YAP／TAZTEAD复合物，构成Hippo途径的核转录模块，在乳腺癌细胞增殖、肿瘤形成等发挥作用［10］。但鲜见ETF对乳腺癌细胞周期影响的报道。本研究拟探讨ETF在乳腺癌组织及细胞中的表达情况，以及ETF对乳腺癌细胞增殖能力的影响，为乳腺癌诊断、治疗及预后评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月至2020年12月沈阳市积水潭医院普外科收治的76例乳腺癌患者的临床资料。纳入标准：（1）所有患者均为女性；（2）术后经病理组织学确诊为原发性乳腺癌，术前未进行放化疗等治疗；（3）手术切除的均有原发性乳腺癌组织和相应癌旁组织；（4）病例记录完整。排除标准：（1）年龄大于80岁；（2）伴有其他肿瘤；（3）经受过其他治疗；（4）临床资料不完整；（5）不愿参加本研究。患者年龄29~73岁，平均（57.47±7.96）岁。肿瘤及癌旁组织均取自同一患者，留取组织标本置于生理盐水中，去除组织标本上的血污后，置于液氮保存待用。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 药品与试剂 人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7细胞和人正常乳腺细胞MCF10A（美国ATCC公司）；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；慢病毒包装试剂盒（合肥知恩生物公司）；细胞全蛋白提取试剂盒（凯 基 生 物 公 司）；抗 体ETF、Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1、RB、p－RB（美国Cell Signaling Technology公司），二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂、ECL发光剂、CCK－8细胞增殖试剂盒（碧云天生物科技有限公司）；SuperScriptⅢ试剂盒（Invitrogen公司）；其他化学试剂（生工生物有限公司）。

1.3 主要仪器 Western blot及转膜设备（BioRad公司）；显影机（广州博鹭腾生物有限公司）；StepOne型号荧光定量PCR（美国AB Applied Bio⁃systems公司）；紫外吸收光度仪（BioRad公司）；流式细胞仪（Becton Dickinson公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化 将76例乳腺癌组织和癌旁组织切片后，置于60℃烘箱中烘烤20 min；二甲苯脱蜡2次，每次5 min；分别采用无水、95%、70%的乙醇脱水各2次；3%双氧水甲醇处理切片，抑制内源性过氧化物酶活性；羊血清封闭2 h。ETF抗体1∶200处理后样本，4℃过夜。次日，PBS清洗3次后加入二抗，二氨基联苯胺显色。

1.4.2 细胞培养、分组和细胞转染 人正常乳腺细胞MCF10A、人乳腺癌MDA－MB－231／MCF－7细胞培养于10% FBS DMEM培养基，置于37℃5% CO2培养箱，待细胞进入对数生长期进行实验。根据慢病毒包装试剂盒说明书进行操作，把感染的MDA－MB－231／MCF－7细胞培养72 h，收集培育中的清液，即慢病毒液。随即采用嘌呤霉素筛选感染的靶细胞，挑选出MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组和阴性对照组MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC，未感染MDA－MB－231／MCF－7细胞作为空白对照组。

1.4.3 RT－qPCR 分别检测76例乳腺癌组织和相应癌旁组织、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7细胞中相关因子mRNA表达。采用Trizol试剂裂解组织或细胞，按照RNA提取试剂盒说明书进行。采用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。采用SYBR试剂盒进行RT－PCR，PCR反应体系进行40个循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.4 Western blot法 分别检测76例乳腺癌组织和相应癌旁组织，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDAMB－231／MCF－7细胞中相关蛋白表达。按照细胞全蛋白提取试剂盒说明书进行蛋白提取，采用NP40裂解液将组织匀浆或细胞吹散，计算样本蛋白浓度。取30 μg全蛋白于15% SDS－PAGE进行分离，电转至NC膜，将脱脂奶粉于室温封闭1 h；一抗4℃过夜，二抗37℃1 h；ECL发光。

1.4.5 细胞增殖实验 将MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7组细胞制成4×105个／ml细胞悬液，接种于96孔板中，按照CCK－8细胞增殖试剂盒说明书进行操作，按照0、12、24、36、72、96 h进行时间设定，检测前4 h每孔加入5 μl CCK－8试剂，弃培养液，在450 nm处测定吸光度值（OD）值。OD代表细胞数目，每组3个复孔。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞周期 将MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC和MDA－MB－231／MCF－7组细胞制成5×106个／ml细胞悬液置于24孔板，按照细胞周期检测试剂盒说明书进行操作，加入实验用培养基，48 h后，PBS洗涤2次，离心收集细胞。70%乙醇固定4℃过夜，次日PBS洗涤3次，加入1 mg／ml PI染液，室温避光孵育30 min后，检测细胞周期分布。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和独立样本t检验；计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ETF在乳腺癌及癌旁组织中的表达 免疫组化结果显示，在76例乳腺癌组织和癌旁组织中，ETF蛋白表达的阳性率分别为73.68%（56／76）和17.11%（13／76） （χ2＝49.070，P＜0.01）。ETF蛋白主要定位在细胞质中，图1A。RT－qPCR和Western blot检测结果显示，ETF在乳腺癌组织中mRNA及蛋白表达水平均显著高于癌旁组织（P＜0.01），见图1B、C。

图1 ETF在乳腺癌及癌旁组织中的表达

2.2 ETF对乳腺癌细胞增殖的影响 利用慢病毒感染的方式构建过表达ETF MDA－MB－231／MCF－7细胞株，检测ETF对乳腺癌细胞增殖的影响。首先采用RT－qPCR和Western blot检测MCF10A组、MDA－MB－231／MCF－7组、MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC组中ETF表达情况，结果显示ETF在MDA－MB－231／MCF－7细胞中的表达显著高于MCF10A细胞（P＜0.01），ETF在乳腺癌细胞中过表达。ETF在MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组中的表达显著高于阴性对照组与空白对照组（P＜0.01），成功构建ETF过表达的乳腺癌细胞系，见图2A－B。采用CCK－8实验检测不同细胞组的增殖情况，结果显示在各个时间点MDA－MB－231与MDA－MB－231－NC、MCF－7与MCF－7－NC组细胞增殖差异无统计学意义（P＞0.05）。而在48、72、96 h处，与MDA－MB－231／MCF－7组细胞比较，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组细胞增殖显著增强（P＜0.01），见图2C。

图2 ETF对MDA－MB－231／MCF－7细胞增殖的影响

2.3 ETF对乳腺癌细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，与MDA－MB－231／MCF－7、MDAMB－231－NC／MCF－7－NC组相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组细胞周期中G1／S期细胞比例显著降低（P＜0.01），G2／M期细胞比例显著增加（P＜0.01），细胞周期进程加快（P＜0.01），见图3A。RT－qPCR和Western blot结果显示，与MDA－MB－231／MCF－7、MDA－MB－231－NC／MCF－7－NC组相比，MDA－MB－231－ETF／MCF－7－ETF组Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1 mRNA和蛋白表达均显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.01），RB mRNA和蛋白水平与阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但其磷酸化蛋白水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.01），见图3B、C。

图3 ETF对MDA－MB－231／MCF－7细胞周期及相关细胞周期蛋白的影响

3 讨论

乳腺癌是女性恶性肿瘤发病率最高的癌症，预估到2020年，全球乳腺癌患者将达1 785万，且呈年轻化趋势［11］。因此，研究乳腺癌发病的分子机制，寻找能够大大提高乳腺癌早期诊断的肿瘤标志物就显得尤为重要。

转录因子ETF的转录产物在肿瘤发展过程中起着重要作用，与人类恶性肿瘤的临床病理参数密切相关，可作为判断预后的生物标志物。在肝癌组织中ETF和VGLL4 mRNA的表达均显著高于正常对照组，且在晚期患者的肝癌组织中ETF mRNA的表达高于早期患者，且ETF和VGLL4 mRNA高表达与上皮－间充质转化和血管生成有关，提示ETF和VGLL4在肿瘤发生发展进展中发挥重要作用［12］。在神经胶质瘤U87－MG、LN229细胞中发现YAP1促进ETF入核，且复合物能够直接作用MES基因启动子，进而调控肿瘤细胞周期进程［13］。

目前鲜见关于ETF对乳腺癌增殖影响的报道，因此本研究检测ETF在乳腺癌组织中的表达情况，结果显示其在乳腺癌组织中的阳性率显著升高，与体外细胞中检测结果相似，提示ETF蛋白高表达可能与乳腺癌的发生发展密切相关。在体外构建高表达ETF蛋白的乳腺癌细胞系，并检测ETF对乳腺癌细胞增殖的影响，结果显示ETF能够促进乳腺癌细胞的增殖。在对机制研究中发现，ETF能够通过提升G2／M期细胞比例，使细胞周期进程加快。在检测周期相关蛋白表达时发现，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB在MDAMB－231－ETF／MCF－7－ETF组表达量显著高于阴性对照组和空白对照组，因此，提示在乳腺癌细胞稳 转ETF后，通 过 提 高Cyclin D1、CDK4、CDK6、Cyclin E1和p－RB的表达，使细胞更快速通过G1／S期，G2／M期细胞比例高，加快细胞周期进程。RB是抑癌基因，非磷酸化形式存在于G0／G1期，磷酸化形式存在于S／G2期，RB过度磷酸化是其失活的重要机制，进而导致细胞周期及细胞增殖异常［14－15］。提示ETF通过调节周期相关蛋白表达加速乳腺癌细胞增殖。

综上所述，ETF与乳腺癌发生发展密切相关，可成为潜在的临床早期诊断及不良预后的标记物。接下来本课题组将会继续探究ETF对乳腺癌细胞凋亡、侵袭转移等方面的影响，为乳腺癌的发生发展的标志物和潜在的重要靶点奠定理论基础。