室内空调机滤尘网尘螨、腐食酪螨变应原基因的检测

薛琪琪，许薇，朱志伟，赵金红

（皖南医学院基础医学院医学寄生虫学教研室，安徽 芜湖241002）

粉螨分布广泛，普遍孳生于面粉、储粮、储藏食品、中药材以及居室环境的灰尘中，有些种类可以成为引起人类过敏性疾病的重要过敏原，导致螨性皮炎、螨性哮喘，甚至人体内螨病［1－2］，对人类健康产生危害。室内空调机滤尘网也是粉螨孳生的重要场所，空调运行时可将粉螨产生的大量变应原通过空调风吹入室内空气中，被人体吸入后可诱发哮喘等过敏性疾病。其中粉尘螨（Dermatophagoides farinae）、屋尘螨（Dermatopha⁃goides pteronyssinus）和腐食酪螨（Tyrophagus pu⁃trescentiae）是 粉 螨 中 常 见 的 过 敏 原 种 类［3］。Voorhorst等［4］在1964年的研究已经证明尘螨是屋尘中的主要过敏原之一。Arroyave等［5］的研究显示，粉尘螨和屋尘螨是最主要的2种吸入性过敏原，可导致全身性过敏性疾病包括过敏性鼻炎、哮喘、变应性球结膜炎、荨麻疹、特应性湿疹（皮炎）等。近年来，已有研究对空调空气滤网中屋尘螨、粉尘螨的变应原进行检测，但尚未涉及其他粉螨变应原的研究。故本研究分别对安徽合肥、芜湖、淮南、淮北4个地区的室内空调机滤尘网进行采集，检测空调机滤尘网灰尘中是否含有屋尘螨、粉尘螨和腐食酪螨变应原，为防治由于粉螨引起的过敏性疾病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 高速冷冻离心机（美国Beckman公司）、凝胶电泳成像分析系统（美国Bio－Rad公司）、克隆载体pMD19－T（大连Takara公司）；土壤基因组DNA快速抽提试剂盒（SK8233）、Taq PCR Master Mix、DNA聚合酶和DNA marker均购于上海生物工程有限公司。

1.2 样本采集 共采集家用空调（包括柜式空调和壁挂式空调）灰尘144份，分别包括芜湖、合肥、淮北、淮南32份、36份、41份、35份。采集时间为夏季7~9月。采集时取下空调机滤尘网，用毛刷轻轻将灰尘扫入盘中，再将灰尘样本分别装入收集管内，记录采集时间、地点和采集人等信息后备用。

1.3 DNA提取、引物设计和PCR克隆扩增

DNA提取采用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒（SK8233）并作稍加改动，根据Genbank公布的粉尘螨1类变应原（Der f 1）（AB034946）、屋尘螨1类变应原（Der p 1）（U11695）以及腐食酪螨1（Tyr p 1）（DQ983317）设计引物序列（表1）。

表1 粉尘螨、屋尘螨、腐食酪螨1类变应原基因引物序列

引物交由通用生物工程有限公司合成。PCR反应总体积为25 μl，含12.5 μl Taq DNA聚合酶、2 μl DNA模板、上下游引物各1 μl、8.5 μl无菌水补足。PCR反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸60 s，34个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖电泳和DNA胶回收试剂盒纯化后，连接到载体pMD19－T中，转化至大肠杆菌（DH5α感受态细胞）中，通过蓝白斑筛选，将阳性克隆委托通用生物技术有限公司采用DNA测序仪（ABI－3730）进行测序。

1.4 序列处理与分析 对测序结果利用DNAMAN软件进行拼接和人工校正，将获得的核苷酸序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，以确定是否为目标片段。为避免PCR扩增可能导致的错配而造成假象的多态性，本研究中用于数据分析的每条序列在同一个体中至少来自3个阳性克隆。

2 结果

2.1 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1扩增结果 以提取的空调机滤尘网灰尘DNA为模版，采用特异性引物扩增Der f 1、Der p 1、Tyr p 1变应原基因，PCR产物经1%琼脂糖电泳后，144份灰尘样本中有30份检测出Der f 1变应原基因，33份检测出Der p 1变应原基因，10份样本检测出Tyr p 1变应原基因。Der f 1基因扩增结果目的片段长度为266 bp，Der p 1基因扩增结果目的片段长度为282 bp，Tyr P 1基因扩增结果目的片段长度为227 bp（图1）。

2.2 Der f 1、Der p 1和Tyr p 1基因同源性比对结果 本研究检出安徽地区的Der f 1的基因序列与已知日本东京地区检出的Der f 1基因（Genbank登录号AB034946）、泰国地区检出的Der f 1基因（Genbank登录号DQ185509）、中国深圳地区检出的Der f 1基因（Genbank登录号EF139430）核苷酸序列同源性分别为100%、99.62%、99.62%。

检出安徽地区的Der p 1的基因序列与澳大利亚的柏斯和悉尼地区检出的Der p 1基因（Gen⁃bank登录号U11695）、美国北卡罗来纳州检出的Der p 1基因序列（Genbank登录号KJ542093）、中国盐城地区检出的Der p 1基因（Genbank登录号EU148599）核苷酸序列同源性分别为100%、99.64%、98.95%。

检出安徽地区的Tyr p 1的基因序列与新加坡地区检出的Tyr p 1基因序列（Genbank登录号DQ983317）核苷酸同源性为100%。

M：DNA marker；1：粉尘螨1类变应原（Der f 1）；2：屋尘螨1类变应原（Der p 1）；3：腐食酪螨1类变应原（Tyr p 1）图1 粉尘螨1类变应原（Der f 1）、屋尘螨1类变应原（Der p 1）、腐食酪螨1类变应原（Tyr p 1）扩增产物图

2.3 不同地区空调机滤尘网灰尘Der f 1、Der p 1和Tyr p 1检测结果 在安徽省4个不同城市中，对Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的基因检测结果也具有一定的差异。Der f 1、Der p 1和Tyr p 1的阳性检测结果大多集中在合肥和芜湖2个城市中，淮北、淮南空调机滤尘网灰尘Der f 1、Der p 1和Tyr p 1检测的阳性结果较少。144份空调机滤尘网灰尘中，Der f 1基因阳检出率为20.83%（30／144），Der p 1基因阳性检出率为22.92%（33／144），Tyr p 1基因阳性检出率为6.94%（10／144），其中Der f 1和Der p 1基因阳性率较高。同时发现其中16.67%（24／144）的样本同时检测出Der f 1和Der p 1 2种变应原，只有2.08%（3／144）的样本同时检测出了Der f 1、Der p 1、Tyr p 1 3种粉螨变应原（表2）。

表2 不同地区空调机滤尘网灰尘Der f 1、Der p 1、Tyr p 1检测结果

3 讨论

粉螨是引起过敏性疾病的主要原因之一，而粉尘螨、屋尘螨和腐食酪螨又是居室中常见的螨类。当清理卫生时可以将它们拍起悬浮于空中，被空调吸入并附着于空调机滤尘网中。当空调长期未清理时，滤尘网中就会附着许多灰尘和微生物，其中可能就包括屋尘螨、粉尘螨和腐食酪螨等。当再次开启空调时，空调机滤尘网中的灰尘就会随着空调风排入室内空气内，其灰尘中包含的尘螨变应原就有机会和人体直接或间接接触，从而导致螨过敏性疾病如螨性皮炎、哮喘和螨病等［8－9］。湛孝东等［10］采用ELISA法检测了从芜湖市区不同地区中采集的空调隔尘网灰尘的Der f 1、Der p 1的浓度及灰尘提取液的过敏原性，结果证实芜湖地区居民空调隔尘网中含有尘螨过敏原。练玉银等［11］分别对尘螨过敏的哮喘患者家庭及健康家庭进行空调使用前后空气中和空调滤网中灰尘的尘螨主要变应原进行检测，发现空调机滤尘网灰尘中存在尘螨抗原，这是室内尘螨变应原的重要来源，可以导致过敏性哮喘。马忠校等［12］检测了开启空气净化器前后室内空气中尘螨主要过敏原的含量变化，发现使用空气净化器可明显降低室内空气中的尘螨过敏原的浓度。

空调滤尘网灰尘中可含有多种引起过敏性哮喘的螨类。王克霞等［13］采集了安徽省芜湖市居民空调隔尘网灰尘样本，进行粉尘螨和屋尘螨1、2、3类变应原基因的检测，结果发现螨性变应原基因检出率为85%，其中以粉尘螨和屋尘螨1、2类变应原基因为主。但目前对于空调机滤尘网中是否含有腐食酪螨变应原鲜见报道，故本研究为了进一步证实空调机滤网灰尘中存在尘螨变应原，以及检测空调机滤尘网中是否含有腐食酪螨变应原，从安徽淮南、淮北、合肥、芜湖4个地区采集共144份样本进行检测，结果显示，空调机滤尘网中的粉螨变应原基因检出率最高的是Der p 1（22.92%，33／144），其次为Der f 1（20.83%，30／144）和Tyr p 1（6.94%，10／144）。说明空调机滤尘网中沉积的灰尘中含有屋尘螨、粉尘螨和腐食酪螨变应原，尘螨变应原为空调机滤尘网中的主要变应原。并且本研究结果还发现，在同一份灰尘样本中可以同时检测出2种或2种以上尘螨变应原，由此可见，当空调机滤尘网中同时含有粉尘螨、屋尘螨变应原时，也含有腐食酪螨变应原，三者之间并无冲突。本研究中尘螨检出率低于王克霞等［13］的研究（检出率为85%，17／20），可能与所采集的空调机滤尘网经过定期清洗次数，或者采集后样本保存时间等有关。白羽等［14］首次用分子生物学方法证实了深圳地区、北京地区空调滤尘网灰尘中检测到Der f 1和Der p 1基因，且深圳地区Der f 1和Der p 1基因检出率为100%，而北京地区空调滤尘网灰尘中同时Der f 1和Der p 1基因的检出率仅为40%，指出因深圳地区常年温暖潮湿，更适于粉尘螨和屋尘螨的孳生繁殖。本研究发现，来自于合肥、芜湖的样本检出率高于来自于淮南、淮北的样本检出率，也可能是由于合肥、芜湖处于安徽中部到南部地区，相较于安徽北部气候较为湿润，更适宜尘螨和腐食酪螨的孳生。然而目前关于合肥、芜湖、淮南、淮北地区人群的螨性哮喘发病率比较尚无报道，因此本研究结果可为上述地区人群螨性哮喘发病奠定理论基础。

综上所述，安徽合肥、芜湖、淮南、淮北4个地区的空调机滤尘网中存在尘螨和腐食酪螨变应原，应重视空调的清洁与净化、定期清洗，并且经常更换隔尘网，可以减少尘螨和腐食酪螨的孳生，有效地降低居住环境中变应原的含量，通过减少致敏因素从而降低过敏性疾病的发病率。