沉默miR-208b-3p对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及机制

温淑珍 王娜娜 徐晓明 陈倩

(青岛市中医医院(市海慈医院) 1心内二科，山东 青岛 266033；2干部保健科；3浙江省中医院心内科)

临床医学将冠状动脉急性、持续性供血、供氧不足而导致的机体心肌组织细胞坏死症状称为急性心肌梗死，急性心肌梗死患者主要临床表现为胸骨后持久、剧烈疼痛，严重威胁患者身体健康甚至生命安全〔1，2〕。近年来，我国急性心肌梗死发病率连年上升，引起广大专家学者的关注〔3〕。临床常用的治疗急性心肌梗死的手段包括外科手术、溶栓治疗、介入治疗等，具有一定的治疗效果，但是有研究表示，急性心肌梗死患者接受治疗时，可能会出现心肌组织损伤程度更加严重的情况，临床医学将之称为再灌注损伤〔4，5〕。再灌注损伤进一步加重患者心肌损伤严重程度，对患者预后造成严重威胁，因此减轻心肌细胞缺血再灌注损伤成为许多目前临床研究热点方向〔6，7〕。本研究中建立心肌细胞缺血再灌注损伤模型，靶向调控miR-208b-3p表达，旨在探究调控miR-208b-3p表达对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1材料 研究细胞：H9c2心肌细胞株(中国医学科学院)。主要试剂：小鼠抗兔miR-208b-3p抗体(BD公司)；小鼠抗大鼠Nemo样激酶(NLK)抗体(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠过氧化氢酶(CAT)、晚期氧化蛋白产物(AOPP)抗体(Hyclone公司)；小鼠抗大鼠白细胞介素(IL)-17、IL-1β抗体(Sigma公司)；大鼠抗兔哺乳动物ATGb同源蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链(LC)3-Ⅱ抗体(Invitrogen公司)；兔抗大鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)抗体(Gibco公司)；兔抗小鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体(Selleck公司)。本研究获得医院伦理委员会批准。

1.2细胞分组处理 将H9c2心肌细胞株分为正常组、模型组、过表达组、沉默组，使用模型组、过表达组、沉默组细胞建立缺血再灌注损伤模型：将细胞接种于6孔板，添加DMEM高糖培养液2 ml(含胎牛血清)，使用37℃ CO2培养箱恒温培养，细胞壁长满6孔板后将DMEM培养液去除，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后添加2 ml培养液(不含血清)，将6孔板置于缺氧小盒内盖上盒盖，经通气孔输注99%氮气10 min，去除培养液后PBS清洗3次，再次添加DMEM高糖培养液2 ml(含胎牛血清)，5%CO2、37℃孵箱内培养120 min。

1.3慢病毒载体构建 miR-208b-3p上游引物序列：5′-GCATAAGAC-GAACAAAAG-3′；下游引物序列：3′-TGGAGCCT-GGGACGTG-5′。正反链混合后加入退火缓冲液，96℃反应4 min，冷却，生成双链。使用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，100倍稀释退火产物后与其连接，20℃水浴过夜，大肠杆菌DH5α转化，次日选择单克隆菌落，30 μg/ml Kana的LB培养液中接种，2 000 r/min离心，孵育过夜。模型组、过表达组、沉默组细胞重悬处理后分别加入4 μg生理盐水、pcDNA3.1-miR-208b-3p、miR-208b-3p-siRNA，电击后常温保存2 h，培养箱内培养取出后添加含800 μg/ml G418的培养基再次培养。

1.4miR-208b-3p、NLK表达检测 RT-PCR检测miR-208b-3p、NLK表达。提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的miR-208b-3p、NLK表达量。

1.5酶联免疫吸附试验检测CAT、AOPP、IL-17、IL-1β 设置10个标准孔，设置1个空半空及若干待测样品，在10 μl待测样品中加入40 μl样本稀释液，封板膜封板，置于37℃水浴箱温育30 min，清洗反应板5次，每次间隔30 s，拍干，在除空白孔以外的各孔中加入酶标液50 μl，封膜温育30 min，清洗反应板5次，每次间隔30 s，拍干，在各孔中加入显色A液、B液各50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光环境下显色15 min，在反应孔内加入终止液50 μl/孔以终止反应，450 nm波长测量每孔吸光度，检测CAT、AOPP、IL-17、IL-1β水平。

1.6细胞凋亡、周期分布检测 TUNEL法检测细胞凋亡，流式细胞术检测细胞周期分布，观察计算各组细胞凋亡率及细胞周期分布情况。

1.7Beclin-1、LC3-Ⅱ、PI3K、Akt、mTOR相对表达量检测 使用Western印迹法检测。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白变性后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后依据蛋白分子大小把凝胶切开并转移至PVDF膜上，用Western封闭液把待测蛋白和内参蛋白封闭90 min在室内，按1∶1 000加到待测蛋白抗体，内参抗体以1∶2 000加入c-fos抗体，孵育过夜4C，使用Western洗涤液洗涤5次，每10 min 1次。按1∶5 000加入稀释山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G，孵育60 min室温水平摇床，洗涤5次Western洗涤液，每10 min 1次。经过电化学发光(ECL)显色和曝光后，进行BIO-RAD成像，使用Image J图像分析系统检测条带的灰度值，以内参条带灰度值与蛋白比值为结果统计分析。

1.8统计学处理 使用SPSS26.0软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1miR-208b-3p、NLK表达比较 与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞miR-208b-3p表达较高，NLK表达较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组细胞miR-208b-3p表达较低，NLK表达较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2各组细胞氧化应激、炎症反应比较 与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞CAT水平较低，AOPP、IL-17、IL-1β水平较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组细胞CAT水平较高，AOPP、IL-17、IL-1β水平较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3各组细胞凋亡、周期分布情况比较 与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞各时间点凋亡率较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组细胞各时间点凋亡率较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞处于G1期的比例较低，处于S、G2期的比例较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组G1期细胞比例较高，S、G2期比例较低，具有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表1 各组细胞miR-208b-3p、NLK表达氧化应激、炎症反应比较

表2 各组凋亡、周期分布比较

2.4各组细胞自噬相关蛋白相对表达量比较 与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ相对表达量较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ相对表达量较低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图1。

表3 各组细胞自噬相关蛋白相对表达量比较

图1 细胞自噬相关蛋白表达

2.5各组细胞PI3K/Akt通路蛋白相对表达量比较 与正常组比较，模型组、过表达组、沉默组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组、过表达组比较，沉默组细胞PI3K、Akt、mTOR相对表达量较高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表4、图2。

表4 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白相对表达量比较

图2 PI3K/Akt通路蛋白表达

3 讨 论

心血管疾病是临床最常见的致死病因，急性心肌梗死是临床常见的心血管疾病，具有发病率高、治疗难度大、病死率高的特点〔8，9〕。介入、溶栓等再灌注疗法是临床常用的治疗急性心肌梗死的手段，再灌注治疗虽具有一定的临床疗效，但可能会出现再灌注损伤，严重威胁患者预后〔10，11〕。氧化应激、细胞凋亡、自噬、坏死等均是心肌细胞缺血再灌注损伤的危险因素，减轻再灌注损伤对阻断心肌细胞凋亡、维持心功能、改善患者预后具有重要意义〔12〕。

miRNA具有特异性、稳定性、保守性等特点，与组织细胞增殖、侵袭、分化等生物学行为密切相关。miR-208b-3p是miRNA家族的重要成员，其表达变化与细胞凋亡能力变化具有密切联系〔13〕。NLK为miR-208b-3p靶基因，是Wnt信号通路的重要组成因子，其表达变化与细胞凋亡密切相关〔14〕。本文研究结果显示，沉默miR-208b-3p表达的再灌注损伤细胞NLK表达上调，出现这一研究结果的原因可能是NLK为miR-208b-3p靶基因，沉默miR-208b-3p表达能够靶向调控NLK表达，从而对心肌细胞缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。

有研究表示，机体心肌细胞的存活情况与机体抗氧化能力、炎症反应密切相关〔15，16〕。随着再灌注损伤的发生，Ca2+内流，细胞活性氧增多，活性氧具有促进细胞自噬的作用，因此抗氧化能力强弱与细胞自噬具有密切联系。CAT是机体防御系统的重要酶类清除剂，能够清除过氧化氢，减轻细胞损伤。AOPP是常用的体现机体氧化应激反应严重程度的产物。IL-17、IL-1β水平变化与炎症反应密切相关。本文研究结果显示，沉默miR-208b-3p表达的再灌注损伤细胞CAT、AOPP、IL-17、IL-1β受到明显调控，说明沉默miR-208b-3p表达能够提升心肌细胞缺血再灌注损伤后抗氧化能力，减轻氧化应激损伤、炎症反应严重程度，从而起到减轻细胞损伤的作用。

细胞凋亡、周期分布与心肌细胞缺血再灌注损伤密切相关，有学者在研究中表示，心肌细胞再灌注损伤发生时，伴随着严重的心肌细胞凋亡情况〔17〕。细胞周期分布在再灌注损伤发生发展过程中也起到重要作用，有研究表示，阻滞细胞周期分布能够抑制细胞凋亡〔18〕。本文研究结果显示，沉默miR-208b-3p表达的再灌注损伤细胞凋亡率较低，G1期细胞比例较高，说明沉默miR-208b-3p表达能够阻滞细胞周期分布，抑制心肌细胞凋亡，出现这一研究结果的原因可能与调控细胞自噬、凋亡蛋白表达有关。

细胞自噬与再灌注损伤具有密切联系，细胞自噬具有一定的保护细胞的作用，但是，再灌注状态下，过度细胞自噬会使细胞损伤严重程度加重。Beclin-1、LC3-Ⅱ是细胞自噬标志物，常用于细胞自噬情况的检测〔19，20〕。PI3K/Akt信号通路相关蛋白P13K、Akt、mTOR蛋白表达变化与细胞凋亡能力密切相关，靶向调控PI3K/Akt信号通路蛋白表达，能够对细胞增殖、凋亡能力进行干预〔21，22〕。本文研究结果显示，沉默miR-208b-3p表达的再灌注损伤细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表达下调，PI3K、Akt、mTOR表达上调，说明沉默miR-208b-3p表达能够通过调控自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡相关蛋白PI3K、Akt、mTOR表达，抑制再灌注损伤细胞自噬、凋亡，从而对心肌细胞缺血再灌注损伤起到一定的保护作用。

综上所述，沉默miR-208b-3p表达能够减轻缺血再灌注损伤心肌细胞氧化应激损伤、炎症反应，抑制心肌细胞凋亡、自噬，阻滞细胞周期分布，其机制可能为沉默miR-208b-3p表达能够调控自噬蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及细胞凋亡通路PI3K/Akt相关蛋白表达，从而减轻心肌细胞缺血再灌注损伤程度，为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供新的研究方向。