毛蕊花糖苷调控Snail1表达在糖尿病肾脏疾病中上皮细胞-间质转化中的作用

郑帅 杨敏 白彝华 肖明鲜 张馨心 马丽 胡绍兰

(昆明医科大学第二附属医院肾脏内科，云南 昆明 650101)

糖尿病肾脏疾病(DKD)是糖尿病(DM)最重要的并发症之一〔1〕。目前已成为终末期肾脏病(ESRD)的主要发病原因〔2〕。已有研究发现,1型DM和2型DM发病均与机体免疫状态异常有关。T细胞浸润导致的胰岛β细胞功能受损可诱导1型DM的形成,而2型DM则与免疫及炎症反应引起的胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能减退有关，并可能是疾病持续性进展的关键〔3〕。有报道,DKD发病前数年患者体内就有炎症反应增强的迹象〔4〕。尽管机制不清,但多数学者认为,炎症反应在DKD微血管病变、动脉硬化及与此相关并发症的发生发展中起到了关键作用。目前证实,机体在环境和基因双重因素的作用下,免疫过度激活和持续的炎症状态可引起血糖升高、肾纤维化及血流动力学改变〔5〕。

上皮细胞-间质转化(EMT)是DKD的主要病理表现，它是肾纤维化的一个重要的过程也是机体免疫过度激活的重要表现。EMT参与肾纤维化的发展主要包括两个方面：一方面通过改变上皮细胞基因蛋白的表达谱，下调上皮细胞标志蛋白如 E-钙黏蛋白(E-cadherin)、角蛋白、闭锁蛋白的表达，上调间质细胞标志蛋白如波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白、成纤维细胞特异蛋白(FSP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达。同时，α-SMA 在肾脏的表达水平可以反映肾间质纤维化的严重程度；另一方面，间质细胞被激活后分泌的大量基质蛋白等细胞因子参与细胞外基质的合成，促使细胞外基质异常积聚和增多，进一步促进肾纤维化的发展〔6～8〕。研究表明〔9〕，EMT在肾脏疾病中发挥着重要作用，而干预EMT则能有效改善肾脏纤维化。而这一病理过程包含一系列的信号通路和多种细胞因子。Snail通路被认为是介导EMT和其他细胞纤维化的一条重要通路，也是机体免疫过度应激的一种重要表现。一些细胞学研究证明〔10〕，Snail因子会导致上皮细胞丢失黏附因子并出现机体免疫异常，最终导致EMT。因此，Snail1是DKD进展的关键。

本研究旨在探讨毛蕊花糖苷在延缓肾功能恶化中的免疫机制。高糖诱导肾病模型是经典研究模型之一，被广泛应用于由于DKD引起机体过度免疫应激而造成的肾纤维化的研究当中。本研究通过STZ诱导大鼠引发DKD模型探讨并证实毛蕊花糖苷是否存在延缓肾纤维化及抑制过度免疫应激的作用。

1 材料与方法

1.1DKD大鼠模型的建立 体重150～200 g的SD大鼠35只，随机分组。在适应环境3 d后随机分为5组：①C组：对照组(n=7)，②DKD组(n=7)，③A-1组:DKD+毛蕊花糖苷低剂量组(100 mmol/L，n=7)，④A-2组：DKD+毛蕊花糖苷中剂量组(150 mmol/L，n=7)，⑤A-3组：DKD+毛蕊花糖苷高剂量组(200 mmol/L，n=7)。其中除C组外给予STZ，STZ给药方法参照文献〔11〕。STZ诱导组大鼠给予高脂饲料饲养4 w后，给予STZ溶液(35 mg/kg)腹腔注射3 d，末次注射72 h后，尾静脉采血测空腹血糖，2次空腹血糖超过16.7 mmol/L为造DM模型成功，留取正常组与造模组大鼠24 h尿液检测24 h尿蛋白定量。毛蕊花糖苷粉用生理盐水溶解，予以大鼠腹腔注射，1次/d，连续5 d，末次注射后20 d后处死大鼠，戊巴比妥麻醉后处死大鼠，取外周血，肾组织进行下一步检测。

1.2Western印迹 取适量蛋白上清沸水煮变性。每孔上样30 μg蛋白，marker上样5 μl，浓缩胶电压90 V，30 min；分离胶电压120 V，60 min。测量观察胶的大小，将滤纸放入转膜缓冲液中。将聚偏氟乙烯(PVDF)膜做好标记后，然后转移至转膜缓冲液中。转膜60 min。将转膜结束的膜取出，置于事先配置好的封闭液中〔5%脱脂奶粉(1g脱脂奶粉+20 ml TBST)〕。封闭结束后，用TBST，室温漂洗3次。将一抗用稀释剂稀释，用TBST洗液洗膜3次。将二抗用稀释剂稀释。用TBST洗膜3次。显色，曝光。

1.3免疫组化步骤 切片脱蜡，后磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。然后PBS洗3 min×3次。每张切片加一抗、二抗。显色、苏木素复染和分化，最后脱水、封片。

1.4RT-PCR检测肾组织中α-SMA，Snail1的表达 应用TrizolRNA提取液提取肾组织中总RNA；采用HiScript®Ⅱ Reverse Transcriptase(Vazyme公司)试剂盒将RNA逆转录，依据Vazyme公司荧光定量试剂盒-ChamQTM SYBR®qPCR Master Mix操作进行PCR扩增，反应体系：2× ChamQ SYBR qPCR混合物：10 μl；PCR上游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl;PCR下游引物(10 μmol/L，生工)：0.4 μl；50× ROX Reference Dye：0.4 μl；Template DNA：2 μl；无核酸酶水：至20 μl，所用引物序列如下：a-SMA上游：ACTGGGACGACATGGA-AAAG，下游：CATCTCCAGAGTCCAGCACA；Snail1下游：AGCCCA-ACTATAGCGAGCTG，下游：CCAGGAGAGAGT CCCAGATG。

1.5统计学分析 采用SPSS21.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1毛蕊花糖苷对大鼠的新陈代谢及生化指标的作用 与C组相比，DKD组血肌酐、24 h尿蛋白明显增高，A-1组、A-2组、A3组后血肌酐、24 h尿蛋白较DKD组明显下降(均P<0.05)。与C组相比，DKD组血糖明显升高(P<0.05)，而与DKD组相比，A-1组、A-2组、A3组血糖差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 大鼠新陈代谢及相关生化指标

2.2毛蕊花糖苷通过下调α-SMA表达对大鼠肾小管的作用 与C组比较，DKD组α-SMA蛋白和RNA水平明显增高；A-1组、A-2组、A-3组与DKD组比较，α-SMA蛋白和mRNA水平显著降低,且浓度越高表达水平越低(均P<0.05)。见表2，图1，图2。

表2 各组α-SMA mRNA和蛋白表达水平比较

图1 Western印迹检测各组大鼠的α-SMA蛋白

2.3毛蕊花糖苷通过抑制Snail1表达对大鼠肾小管的作用 与C组相比，DKD组Snail1蛋白及mRNA水平明显升高；A-1组、A-2组、A-3组Snail1蛋白及mRNA水平较DKD组明显降低(P<0.05)。见图3、表3、图4。

图2 各组α-SMA免疫组化(DAB，×100)

图3 Western印迹检测各组大鼠的Snail1蛋白

表3 各组Snail1 mRNA和蛋白表达水平比较

图4 各组Snail1免疫组化(DAB，×100)

3 讨 论

由于生活方式和饮食的改变，DM事件的发生率正逐年增长，现在大约有7%的中国成年人是糖尿病患者，数量约为1.14亿人，在患DM 10～20年的患者，近1/3的人将发展为DKD〔12，13〕。DKD的发病机制及其进行性肾损害的机制至今尚未完全明了。目前，DKD考虑与血糖代谢紊乱、肾血流动力学异常、高血压、免疫、遗传等多种因素有关。DM患者因长期高血糖易造成微血管内皮病变,引发肾实质缺血、缺氧,导致机体氧化应激增强,诱发大量炎症因子释放,引发血管炎症反应。过度免疫应激可导致免疫复合物沉积、肾小球滤过功能降低,导致小管EMT,最终导致肾脏损伤。而肾小球硬化是多种原因导致肾小球损伤和病变的共同结局,也是肾功能衰竭的主要病理基础。炎症和免疫功能异常可导致、加重肾脏损伤,导致DKD的发生〔11〕。及时采取有效的措施降低机体炎症反应,减少尿白蛋白,保护肾脏功能是临床治疗DKD的关键。毛蕊花糖苷，又名麦角甾苷、毛蕊花苷，有较好的药用历史和基础。它是一种以β葡萄糖为母核的含有酯酰及氧苷键的天然糖苷，是咖啡酸和羟基酪醇与糖苷连接的一部分，且拥有广泛的药理活性，如肾功能的保护、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡等作用〔14〕。因此，本研究评估了在STZ诱导的DKD大鼠中毛蕊花糖苷的治疗作用及其中可能的免疫机制。

相关研究表明，肾脏组织中α-SMA是活化的成纤维细胞的常用蛋白标志物，α-SMA阳性的肌成纤维细胞是主要的基质合成细胞〔15〕。在正常肾脏组织中，α-SMA在动脉平滑肌细胞中表达，它是平滑肌细胞的标志蛋白，是间质成纤维细胞转化为α-SMA的肌成纤维细胞关键。它是肾间质成纤维的关键，也是导致肾纤维化的重要机制。因此，α-SMA可以作为肾间质纤维化严重程度的重要参考指标。而在DKD组中α-SMA明显增加，说明DKD会导致肾间质中成纤维细胞被大量活化，继而导致肾纤维化。本研究可以观察到DKD大鼠肾组织Snail1蛋白激活。相关报道提示〔16〕，细胞外基质增生和肾小管损伤的进展与Snail1通路有关。Snail 超家族具有锌指结构的转录因子，由Snail1(Snail)，Snail2(Slug)和Snail3(Smuc)组成，在诱导EMT、免疫调节、细胞生存等方面具有关键作用〔17〕。Snail1及其下游的信号通路对于肾脏EMT发挥了至关重要的作用。Snail1可以诱导间充质、侵袭相关基因表型FN的表达，与此同时它是重要的E-cadherin转录调节抑制基因，可以通过下调其他表皮分子，如紧密连接蛋白、闭合蛋白及附膜蛋白，抑制E-caherin的表达，最终参与EMT的调节。Snail1能够下调中胚层和中外胚层的基因表达，在结合E-cadherin基因的启动子区，抑制上皮细胞黏附分子表达，诱导上皮细胞彼此迁移，转变为间充质细胞，进而通过EMT促进中胚层的形成〔18〕。此外，补体系统参与DKD的发生发展，在DKD病理损伤过程中起重要作用，高糖诱导肾组织中C3aR、C5aR增高，导致EMT进而出现肾脏纤维化伴炎细胞浸润〔19〕。毛蕊花糖苷可以通过降低Snail从而降低DKD的补体中的C3aR及C5aR。Li等〔20〕发现，Snail1过表达抑制了小管上皮细胞的E-cadherin、胎盘钙黏素(P-cadherin)及足细胞的肾病蛋白(Nephrin)的表达。Boutet等〔21〕通过体内研究发现，成年转基因小鼠的Snail1活化可以诱导EMT发生和肾的纤维化。Wettstein等〔22〕研究发现，热休克蛋白(HSP)27可以与Snail结合并导致EMT的发生。Adeshara等〔23〕的实验表明通过Snail1通路激活导致的细胞改变符合细胞EMT的改变。Snail1在2型DM患者肾组织中高表达，可能参与了DKD发生、发展过程。多种信号通路参与了Snail1介导的EMT〔24〕。Snail1通路是干预DKD肾纤维化的节点也是重要的药物靶点。本研究结果表明毛蕊花糖苷对DKD引起的肾脏纤维化有较好的疗效。