葱白提取物对癫痫大鼠学习记忆及细胞凋亡的影响

邵延萱 李晶 薛晴 罗文哲

(佳木斯大学 1临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007； 2基础医学院；3研究生院)

神经细胞异常放电可造成常见的神经系统疾病癫痫发生，在生物电发生改变的同时会有一些氧自由基或过氧化物大量产生而破坏神经细胞导致细胞坏死或凋亡，因此，神经细胞坏死或凋亡是癫痫发病的重要机制之一。而探索癫痫神经保护作用的机制也常集中在最敏感的脑区，即皮质和海马部位。葱白提取物的主要成分有多糖、黄酮、脂肪酸及甾体类化合物等，具有抗癌、心血管保护等疗效。目前，未见报道葱白提取物对癫痫模型大鼠脑电图(EEG)、学习记忆能力、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3和抗凋亡因子(Livin)的影响；本文对以上影响进行分析，并探讨葱白提取物的神经保护效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与饲养环境 选取购于哈尔滨医科大学实验动物中心的30只6周龄雄性健壮SD大鼠(初始体重180～200 g)，动物合格证号：SCXK(黑) 2015-001。经佳木斯大学伦理委员会审查通过后开始实验。适应性喂养1 w后开始造模型。

1.2主要试剂与仪器 葱白提取物购于武汉市第一医院；Y迷宫(张家港市三兴教学仪器厂)；BI-2000医学图像分析系统及BL-420N生物信号采集系统(成都泰盟科技有限公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；美国Sigma公司的戊四氮(PTZ)；A型电子精密天平(上海衡平科学仪器有限公司)；链霉亲和素-生物素复合物(SABC)试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)及枸橼酸钠缓冲液、多聚赖氨酸、第一抗兔抗人Livin多克隆抗体、Caspase-3多克隆抗体均购于武汉博士德公司；电动玻璃匀浆机(宁波新芝科技研究所)； TGL-168高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；医用超低温冰箱(日本三洋电器有限公司)；立体定位仪(日本岛津)；4%多聚甲醛。

1.3制造模型方法和分组 30只SPF级SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组各10只。各组处理方式：模型组与治疗组都用PTZ腹腔注射(用双蒸水配成10 g/L 溶液，按35 mg/kg给药)，正常组用相同剂量的生理盐水腹腔注射。治疗组葱白提取物灌胃，50 mg/kg，连续28 d，1次/d；正常组和模型组按相同剂量灌胃生理盐水。灌胃时注意提前禁食6 h，每天固定在同一个时间段进行操作。

1.4记录EEG 用BL-420N生物信号采集系统记录EEG，戊巴比妥钠(浓度是0.4%，按40 mg/kg给药)麻醉成功后把大鼠头部固定在定位仪上，在颅顶正中位置手术刀切开约2 cm切口，暴露骨膜进行操作。在牙科探头介入下加上牙脱粉固定相应的针灸电极，用直径约0.5 mm的针灸针分别放在右侧皮质及海马区域即可。借助立体定位仪设置参数放置不同电极，其中，额叶皮质中线旁和前囟前2.0 mm；中线旁2.0 mm，前囟后3.8 mm是额叶海马电极；额叶皮质0.5 mm、海马2.6 mm为硬膜下电极。按要求准备好后记录EEG，每10 min记录1次，且在大鼠清醒状态下记录的结果更为准确。

1.5学习记忆能力测试 采用Y迷宫即电迷宫。原理是通过人为控制灯光和给予电刺激，让大鼠形成条件反射，以此来判定其空间辨别能力和记忆认知情况。该迷宫有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂，若该臂的信号灯亮了即不通电的安全活动范围。预先淘汰掉反应迟钝及过于敏感的大鼠。测试大鼠在每天的测试中达到正确反应的达标比率，一直连续测5 d。如果接受刺激直接跑至安全范围内即正确反应，学习记忆能力强，反之则学习记忆能力差。若正确率达到90%可记为达标；连续记录5 d的达标率。

1.6颞叶皮质及海马Caspase-3和Livin阳性细胞数 分别检测颞叶皮质及海马Caspase-3和Livin阳性细胞数。给药治疗周期结束后，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉成功后断头取下大脑，固定用4%多聚甲醛，并做包埋处理(用石蜡)。PBS用作一抗的孵育切片是进行阴性对照的，测定颞叶皮质及海马Caspase-3和Livin阳性细胞数分别用Caspase-3、Livin的多克隆抗体。借助医学图像分析系统观察所见视野，查出所在视野范围内所有细胞和符合阳性标准的棕黄色颗粒细胞，可选择多个视野计算平均值。给出平均阳性细胞数目。

1.7统计学方法 采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1EEG 正常组EEG中表现为低幅值的α波、β波或θ波等基础波形；模型组EEG出现很显著的尖波或者棘波，常会有幅值很高的棘波或慢波共存的波形；治疗组EEG中尖样波或棘波的幅值明显较模型组降低，取而代之的是一些慢波，见图1。

图1 3组EEG结果

2.2学习记忆能力 3组连续5 d表现为随着测试时间的延长，每天的达标率都逐渐增加，说明大鼠的学习记忆与空间认知能力日益提高；与正常组比较，相同时间点模型组达标率显著降低(P<0.05)；相同时间点治疗组达标率显著高于模型组(P<0.05)。见表1。

2.3颞叶皮质及海马Caspase-3和Livin阳性细胞数 Caspase-3阳性细胞呈棕黄色的颗粒，常出现在细胞质，也在细胞核出现。与正常组比较，模型组皮质及海马体的阳性细胞数目都显著增多，而海马区阳性细胞数又显著多于颞叶皮质区(P<0.05)，证明海马区是学习记忆的重要基础结构。治疗组Caspase-3阳性细胞数较模型组显著降低(P<0.05)。Livin阳性细胞呈现出棕黄色颗粒，在皮质部分弥散存在于颞叶皮质各个层次；而在海马区的表达主要遍及颗粒细胞和椎体细胞部分。治疗组颞叶皮质和海马区Livin阳性细胞数较模型组显著增多(P<0.05)，即皮质和海马区Livin表达上调；而模型组的颞叶皮质和海马区Livin阳性细胞数较正常组显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 3组学习记忆成绩测试结果、颞叶皮质及海马Caspase-3和livin阳性细胞数

3 讨 论

PTZ建立的癫痫模型具备发作易感性，且与人类发病特点吻合；这种药物对神经细胞没有任何细胞毒性作用，所以常用其建立该模型并探究发病机制及可行的治疗药物。癫痫发病时会出现神经轴突的再生与重塑而造成神经细胞异常兴奋放电，表现为发病机制复杂多变的神经系统功能障碍〔1〕。而参与发病的海马区和颞叶皮质是最具代表性、最敏感的部位。在诸多发病机制中，具有重要作用和意义的便是细胞坏死、凋亡、氧化应激〔2，3〕、炎症反应〔4，5〕等，这当中又有很多信号通路参与，而内质网应激〔6，7〕是调控氧化应激、炎性反应的主要通路之一。目前，癫痫的药物治疗一直是医学工作者研究的热点问题，尤其是不良反应小的中药开发和治疗，这也是医药界关注的重要问题〔8〕。

食用与药用兼具的百合科植物鳞茎就是葱白，其具有减脂、对抗氧化、对抗血小板聚集、疏通微循环、舒张血管以加强氧供等效果。本研究说明葱白提取物可有效减轻大脑神经元的异常放电来改善EEG波形变化，进而发挥了治疗癫痫的作用。

本研究中测试Y迷宫的光辨别学习记忆能力〔9，10〕的结果说明葱白提取物可削弱神经细胞的凋亡、增加神经细胞的营养，以此改善学习记忆。而癫痫发病时脑细胞活性显著受到抑制并增加了细胞凋亡进程从而学习能力减弱。同时，由于颞叶皮质与海马区是学习认知的基础结构，也是癫痫病灶的关键部位。本文研究结果进一步证实了癫痫发病出现的学习认知能力减退和这两个主要脑区神经细胞的坏死和凋亡有联系。本研究验证学习记忆与皮质和海马区神经细胞凋亡紧密相关。因为癫痫异常放电会同时出现细胞凋亡〔11〕。在这一过程中，神经细胞放电异常、脑细胞缺血或缺氧也会进一步加重凋亡。因此一旦发生癫痫首先出现的就是细胞凋亡〔12〕。也可根据细胞凋亡的轻重程度来判断癫痫的病变程度〔13〕。

本研究结果提示，海马是影响学习记忆的重要基础结构；癫痫发作后的神经细胞坏死和凋亡主要与居于中心地位的Caspase-3密切相关，其发挥促凋亡效应；而Livin 的效应却是抑凋亡的发生，原因是Caspase-3能和Livin中凋亡抑制基因重复结构(BIR)结构域结合而削弱 Caspase-3的正常效应，相当于二者发生了拮抗作用。因此证实葱白提取物可能通过增加脑血流量、改善血流贮备、加强脑组织血液循环和氧供应、建立侧支循环来降低神经细胞的损伤和凋亡，以起到神经保护和治疗效果。

综上，癫痫以海马区细胞凋亡为主要表现形式，由于这个脑区又是学习记忆的基础结构部位，因此在癫痫发生时学习记忆能力明显降低。而葱白提取物可通过调节EEG波形的改变，营养神经细胞缓解细胞凋亡的发生来增加学习记忆能力；从而达到神经细胞的保护效果。