大鼠骨骼肌挫伤修复过程中p38MAPK通路、炎症反应的作用

王屿萌 廖苾芝 周达岸

(锦州医科大学附属第三医院康复中心，辽宁 锦州 121000)

骨骼肌钝挫伤是由急性、机械性的顿力造成的损伤，随之产生炎症反应，并导致氧化应激水平发生变化，其特征是皮肤无破损，无外部损伤〔1〕。骨骼肌损伤修复主要源于肌卫星细胞的增殖分化，从原有骨骼肌中进行分离培养获得的肌卫星细胞增生细胞在体外进行培养时被人们统称其为成肌细胞,这类细胞在机体未受到伤害或刺激时仍然处于正常静止活动状态,损伤或突变发生时会被激活,具备自我复制和增殖多向细胞分化的巨大潜能,可以进一步进行增殖单向分化，修复受损肌组织，达到治疗效果〔2,3〕。已有研究表明p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径在骨骼成肌细胞的生长中起着重要作用，在成肌细胞增殖与分化中扮演重要角色〔4〕。冲击波(ESW)是近几年兴起的对肌肉骨骼系统疾病有效的一种新兴治疗技术，ESW能够有效影响细胞增殖与分化，抗炎，扩张血管及血管生成，缓解疼痛，神经修复与再生，加速成骨〔5～10〕。为此本实验首次以ESW作为干预手段，研究p38MAPK信号通路及炎症因子在骨骼肌钝挫伤修复时的表达变化，探讨利用ESW对急性骨骼肌钝挫伤的修复治疗机制作用及其机制,为临床治疗骨骼肌损伤修复提供科学依据。

1 材料与方法

1.1动物与分组 于锦州医科大学IVC动物实验室购买60只健康饲养雄性SD大鼠，8～9 周龄，体重180～200 g，饲养温度控制在20～25℃，湿度40%～50%，动物饲养生产经营许可证注册号：SCXK(辽)2017-0003。60只大鼠随机分为正常组(n=12)、损伤组(n=24)和治疗组(n=24)，其中损伤组与治疗组，每组按照1 d、3 d、7 d、14 d时间点分为4个亚组。实验操作符合锦州医科大学实验动物伦理与福利委员会章程。

1.2主要试剂和仪器 p-38MAPK一抗 、肌细胞生成素(Myogenin)一抗、β-actin(美国，abcam)，磷酸化(p)-p38MAPK一抗(美国，CST)，山羊抗兔二抗(上海，碧云天)，酶联免疫吸附试验试剂盒(上海，酶联生物)，Western印迹相关试剂(上海，碧云天)，光学显微镜(日本，Olympus公司)，电泳及转膜仪器(美 国，BIO RAD 公司)，凝胶成像系统(美国，BIO RAD公司)，体外冲击波治疗仪(瑞士，EMS公司)。

1.3急性钝挫伤模型建立 依照Liu等〔11〕方式，采用自置重物装置打击腓肠肌肌腹。打击物重 16.8 g(直径15.9 mm)，下落高度125 cm，打击头面积约28.26 mm2。这种方法导致的损伤是一种高效钝性创伤，伴随着炎症细胞侵入，之后广泛的肌肉再生〔12〕。各组于不同时间点(第1、3、7、14天)取腓肠肌肌腹。

1.4治疗措施及取材 正常组未给予干预；损伤组不给予治疗；治疗组大鼠于损伤后24 h采用发散式冲击波刺激，作用于大鼠腓肠肌中段。设定参数〔13〕：能流密度0.14 mJ/mm2，频率10 Hz，每次冲击500次，每间隔4 d进行1次治疗，于1 d、3 d、7 d、14 d时取大鼠局部腓肠肌进行检测(其中1 d取材时于治疗结束后即刻进行)。

1.5苏木素-伊红(HE)染色组织学观察 将腓肠肌肌腹固定在4%的多聚甲醛1 h后，石蜡包埋切片(5 μm)并HE染色，在光镜下观察组织病理学改变并采集图像。

1.6Western印迹法 每组分别取100 mg样本，加入适量高效RIPA裂解液，加入100 μl的pH为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，用匀浆器充分匀浆，离心取上清液并进行蛋白定量。电泳开始以90 V恒压1 h，待扩散后，120 V恒压2 h，进行转膜(湿转)，用300 mA恒流1.5 h，电泳后，将膜放入5%脱脂奶粉溶液中1.5 h，TBST洗膜后分别在p38MAPK(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、Myogenin(1∶500)、β-actin(1∶1 000)一抗稀释液中4℃摇床孵育过夜；放入二抗(1∶1 000稀释)在室温下放置1 h；电化学发光(ECL)显影后成像。Image J 软件分析每个目的蛋白灰度值。

1.7酶联免疫吸附试验 取冻存于-80℃冰箱中的血清，按试剂盒说明书依次加入空白孔、标准孔和样品孔，除空白孔，其余孔加酶标试剂，密封，37℃孵育60 min。配制溶液，清洗，依次向每个孔中加入显色剂A和B，轻轻摇匀，显色，然后加入终止液。在450 nm波长下测量每个孔的吸光度(OD值)。

1.8统计学分析 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析和LSD检验。

2 结 果

2.1肌肉形态 正常组：肌肉组织结构正常完整，肌纤维走形整齐，无组织变性、坏死等明显病理结构改变。损伤组较正常组：肌纤维排列紊乱，炎症细胞浸润。治疗组较损伤组：随着治疗进展，肌纤维排列较规则，炎细胞减少。见图1。

2.2各组p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表达比较 损伤组和治疗组的p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin表达量均高于正常组(P<0.01)，同一时间点下，治疗组p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin的表达量相对于损伤组均显著增高(P<0.05)，损伤组和治疗组p38MAPK、p-p38MAPK、Myogenin均在3 d表达量达到峰值(P<0.01)。见表1、图2。

图1 不同组别腓肠肌HE染色(×200)

表1 各组p38、p-p38、Myogenin蛋白及TNF-α、IL-1β含量比较

1～9：正常组，损伤1、3、7、14 d组，治疗1、3、7、14 d组

2.3炎性细胞因子水平 损伤组各个时间点TNF-α、IL-1β的表达量与正常组比较均有显著性差异(P<0.01)，且均在损伤1 d达高峰(P<0.05)。治疗组TNF-α、IL-1β相对于损伤组除第1天增高(P<0.05)，3 d、7 d、14 d都呈下降趋势且具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

3 讨 论

ESW作为一种新型治疗技术，具有高效、安全、多用途、可重复、无创等特点，近年来，广泛应用于治疗许多肌肉骨骼疾病之中〔14〕。ESW作为一种具备力学性质的机械波〔15〕，通过机械传导，以诱导新血管生成和干细胞活动，从而改善组织再生和愈合。已证明ESW上调Myogenin的表达，促进急性骨骼肌损伤后再生〔16〕。同时，也有研究表明ESW在体外实验对成肌细胞具有一定促进增殖与分化作用〔17〕。p38MAPK信号通路在促进成肌细胞分化、肌管生成、卫星细胞增殖方面都发挥着重要作用〔18，19〕。虽然没有研究表明ESW对MAPK激活的影响，但上述所有研究都表明，ESW可以通过激活p38MAPK途径来促进骨骼肌卫星细胞增殖的可能性。且体外成肌细胞不能完全代替体内肌卫星细胞， 成肌细胞和肌卫星细胞之间在细胞成熟水平方面存在显著差异〔20〕。 本研究结果表明ESW通过促进p38MAPK表达进而直接调节MAPK级联反应，致使磷酸化，从而调节肌细胞增殖。通过促进Myogenin增殖即提高肌源性调节因子表达〔21〕，达到组织愈合目的。炎症细胞因子在骨骼肌修复再生的中也起着至关重要的作用，虽然抗炎策略的发展已被广泛认为是提供组织拯救的主要工具，但也必须记住，及时实施促炎模式在组织修复中也起着关键作用〔22〕。近年来，观察到ESW能通过上调人牙周膜中IL-6和TNF-α的表达水平，促进成纤维细胞增殖〔23〕。众所周知，在应激期间，细胞会发生各种反应，包括炎症反应。本研究发现ESW的作用可以初期触发促炎症因子的激活，ESW启动的机械转导可能通过促炎诱导促进肌卫星细胞的增殖，然而长期炎症反应损害机体修复，导致瘢痕增生，是促炎与抗炎失调〔24〕，为此本实验结果表明ESW后期治疗整体都是下降的。根据这些观察，ESW可能初期刺激炎症因子的活性也就可以理解了，所有这些结果表明，ESW可能正向调控骨骼肌修复过程的初始有益炎症反应〔25〕，并使肌卫星细胞增殖与分化“合理化”。

综上，经ESW预后，p38MAPK信号通路被更大程度激活，调控 Myogenin表达增加，增强骨骼肌再生修复。同时减轻炎症反应，促进修复愈合过程。ESW可通过p38MAPK信号通路促进肌卫星细胞增殖，同时减轻炎症反应，到达治疗目的，ESW在减轻肌肉挫伤的炎症和促进肌生成方面具有双重作用。