黄芩苷对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响▲

肖 敏 徐洪来

(广西柳州市人民医院1 皮肤科，2 肝胆外科，柳州市 545006，电子邮箱：501880191@qq.com)

恶性黑素瘤来源于黑素细胞，在皮肤肿瘤中恶性度极高，是致死率最高的一种皮肤恶性肿瘤。近年来，恶性黑素瘤的发病率呈持续上升的趋势[1]。恶性黑素瘤的发病病因和机制尚不十分清楚，目前被认为与长期日光照射、病毒感染、种族、机体免疫功能低下、外伤等多种因素密切相关[2]。对于未转移的黑素瘤，手术切除是主要的治疗手段，患者存活率可达到80%以上[3]。但由于恶性黑素瘤细胞可以逃避免疫系统的监控，易向远处扩散，发生转移早，多数患者就诊时已发生远处转移，因此无法通过手术完全切除[4]。晚期转移性黑素瘤患者则需要接受其他方法进行治疗，如化疗、放疗、免疫治疗和靶向治疗等，但预后不佳，且化疗药物的毒副作用大[5]。因此，寻找安全有效的抗恶性黑素瘤药物是当前的研究热点。黄芩苷是从黄芩的干燥根中提取的一种黄酮类化合物。既往研究发现，黄芩苷具有抗肿瘤作用，对舌癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞具有明显的抑制效果[6]。但黄芩苷对恶性黑素瘤的抗肿瘤作用还鲜有报告。本研究探讨不同浓度的黄芩苷对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖、侵袭和凋亡的影响及其可能机制，为临床治疗恶性黑素瘤提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人皮肤恶性黑素瘤A875细胞购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心；黄芩苷(批号:21967-41-9)购自南京源植生物科技有限公司，使用时用生理盐水溶解配比；RPMI 1640培养基(批号：SH30809.01B)和胎牛血清(批号：021-60348065)购自美国HyClone公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3(批号:ab44976)、Caspase-9(批号:ab52298)、细胞周期蛋白(Cyclin) D1抗体(批号:ab16663)和β-肌动蛋白(β-actin，批号：ab13772)购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(批号:ZF.0311)购自北京中彬金桥生物技术有限公司，四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)试剂盒(批号：G4101-1000T)购自武汉谷歌生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：将A875细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640完全培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。每隔1 d更换1次培养液，胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞分组：将对数生长期的A875细胞分为对照组和实验组，其中实验组又分为80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷组。

1.2.3 MTT法检测A875细胞增殖情况：将A875细胞接种于96孔培养板中，密度为1×104个/孔，按1.2.2方法将细胞分组，每组设6个平行孔。培养24 h待细胞贴壁后，弃去培养基，实验组分别加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷的RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素)，对照组加入等体积培养基。继续在37℃、5% CO2细胞培养箱分别培养48 h、72 h。终止培养，弃去培养基，更换不含黄芩苷的新鲜无血清RPMI 1640培养基。每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，吸除孔内液体，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min使结晶充分溶解，于酶标仪570 nm波长处测定各孔光密度(OD)值，计算细胞存活率。细胞存活率=(OD实验组/OD对照组)×100%。实验重复3次。

1.2.4 细胞克隆形成实验观察细胞克隆形成能力：调整A875细胞密度为200个/孔并接种于6孔板中，按1.2.2方法将细胞分组，每组设6个平行孔。培养24 h待细胞贴壁后，弃去培养基，实验组分别加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷的RPMI 1640培养基，对照组加入等体积培养基，在37℃、5% CO2培养箱中继续培养7 d，其间每隔2 d换液一次(吸除旧培养基，加入新鲜等浓度培养基)。吸除培养板内培养基，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗 2 次，1 min/次，4%多聚甲醛固定细胞30 min。吸除固定液，磷酸缓冲盐溶液冲洗2次，1 min/次，加入0.1%结晶紫溶液染色30 min。去除染色液，磷酸缓冲盐溶液冲洗2次，1 min/次，倒置显微镜下观察细胞状态。以超过50个细胞的细胞团作为一个细胞克隆，计数细胞克隆形成个数，以细胞克隆形成个数表示细胞克隆形成能力。 实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率：取对数生长期的A875细胞，胰蛋白酶消化细胞后制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL，以1 mL/孔接种于6孔板中，按1.2.2方法将细胞分组，每组设6个平行孔。培养24 h待细胞贴壁后，弃去培养基，实验组各亚组分别加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷的RPMI 1640培养基，对照组加入等体积培养基，在37℃、5% CO2培养箱中继续培养72 h，吸除上清液，收集细胞并用冷磷酸缓冲盐溶液清洗细胞2次，1 min/次，再用1×结合缓冲液重悬细胞，取100 μL细胞悬液加入5 mL培养管中，加入5 μL膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和5 μL 碘化丙啶，混匀后室温下避光孵育15 min，各实验管中再分别加入1×结合缓冲液400 μL。1 h内上流式细胞仪测定细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞术检测细胞周期：取对数生长期的A875细胞以1×106个/孔接种于6孔板中，按1.2.2方法将细胞分组，每组设6个平行孔。培养24 h待细胞贴壁后，实验组各亚组分别加入含80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷的RPMI 1640培养基，对照组加入等体积的培养基。在 37℃、5% CO2培养箱中培养72 h，收集细胞并用预冷磷酸缓冲盐溶液 充分洗涤2次，1 min/次，加入75%乙醇固定，4℃静置24 h，预冷磷酸缓冲盐溶液清洗2次，1 min/次，加入20 μL RNase 37 ℃水浴消化30 min，加入0.5 mL 碘化丙啶室温下避光染色30 min，24 h内上流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.2.7 蛋白质印迹法检测A875细胞Caspase-3、Caspase-9、Cyclin D1蛋白表达水平：将对数生长期的A875细胞制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，以1 mL/孔接种于6孔培养板中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，待细胞贴壁，将细胞分为对照组和320 μg/mL黄芩苷组，分别加入含0 μg/mL和320 μg/mL黄芩苷的培养基，继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h。每组设6个平行孔。收集细胞，磷酸缓冲盐溶液清洗2次，1 min/次，加入RIPA裂解液裂解细胞，用蛋白提取试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司，批号：YT8951)提取细胞总蛋白，采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量。将含有等量蛋白的样品用上样缓冲液稀释，置于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(分离胶15%、浓缩胶5%)行电泳分离蛋白，电泳结束后转膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭膜1 h；分别加入Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1、β-肌动蛋白一抗(1 ∶1 000)，4℃ 过夜；加碱性磷酸酶标记的二抗(1 ∶500)，37℃孵育1 h后，用碱性磷酸酶显色液显色后扫描成像。以β-肌动蛋白为内参照，计算Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白相对表达水平。实验重复3次。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度黄芩苷对A875细胞存活率的影响 随着黄芩苷药物浓度的升高和作用时间延长，A875细胞的细胞存活率逐渐下降 (均P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度黄芩苷对A875细胞存活率的影响(x±s， %)

2.2 各组细胞克隆形成能力的比较 对照组、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷组，细胞克隆形成个数依次降低(均P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度黄芩苷对A875细胞克隆形成能力的影响(x±s，个)

2.3 各组细胞凋亡率的比较 对照组、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷组A875细胞凋亡率依次升高(均P<0.05)。见表3。

表3 不同浓度黄芩苷对A875细胞凋亡率的影响(x±s，%)

2.4 各组细胞周期细胞比例的比较 对照组、80 μg/mL、160 μg/mL、320 μg/mL黄芩苷组G0/G1期细胞比例依次升高，S期细胞比例依次下降(P<0.05)，除对照组、80 μg/mL黄芩苷组G2/M期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)外，其余黄芩苷浓度组之间及其与对照组比较，G2/M期细胞比例差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组细胞周期细胞比例的比较(x±s,%)

2.5 各组A875细胞Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表达水平的比较 选取实验中黄芩苷最高浓度组320 μg/mL进行实验，与对照组比较，320 μg/mL黄芩苷组A875细胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平升高， CyclinD1蛋白表达水平降低(P<0.05)。见表5。

表5 各组细胞 Caspase-3、Caspase-9、CyclinD1蛋白表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

黄芩在我国产量大，用药历史悠久，其副作用小，毒性低，价格低廉，因此用途广泛。在传统中医中，黄芩的功效为清热除湿、泻火解毒。黄芩苷是黄芩最有效的化学成分之一，在临床上主要用于治疗心血管疾病、脑缺血、肝炎、肺炎、抗感染等[7]。随着对黄芩苷分子机制研究的逐步深入，学者们发现黄芩苷还具有抗肿瘤作用，近年来的研究显示，黄芩苷对舌癌、食管癌、骨肉瘤、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡[8]。

生物体内细胞的增殖和细胞的死亡之间存在着动态平衡，使多细胞生物个体能够正常生长发育[9]。细胞无限增殖和细胞死亡抑制，是恶性肿瘤的两大显著特征[10]。细胞失控性增殖的原因包括：细胞快速生长和分裂，细胞周期调控紊乱，细胞凋亡减少。细胞周期是指细胞从一次分裂完成的开始，到下一次分裂结束。细胞周期是一种复杂且精细的调节过程，严格按照 G1-S-G2-M 循环运转[11]。细胞通过细胞周期的调控，实现自我更新及个体发育。细胞周期是保证细胞正常生命活动的过程[12]。Cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂三者共同协调完成对细胞周期的调控[13]。Cyclin可分为多种类型，其中CyclinD1推动细胞周期从G1期进入S期，导致细胞增殖[14]。在绝大多数肿瘤细胞中，Cyclin存在着异常激活的现象[15]。因此，细胞周期活动异常，促使细胞持续增殖，是肿瘤细胞的特点。本研究结果显示，不同浓度黄芩苷干预A875细胞48 h、72 h后，随着黄芩苷药物浓度的升高和作用时间的延长，A875细胞的存活率逐渐下降；不同浓度黄芩苷干预A875细胞7 d后，各组细胞克隆个数随着黄芩苷药物浓度的升高而下降(P<0.05)。均表明黄芩苷能抑制A875细胞的增殖，且随着药物浓度的增加和药物作用时间的延长，抑制增殖作用增强，呈现明显的浓度与时间相关性。此外，黄芩苷作用于A875细胞后G0/G1期细胞比例明显上升，S期和G2/M期比例明显下降，且给予320 μg/mL黄芩苷干预后，A875细胞中CyclinD1蛋白表达水平降低，表明黄芩苷可将A875细胞阻滞于G0/G1期，特异性抑制细胞分裂。

细胞凋亡是指由于细胞内外的因素，触发细胞内预存的死亡程序，在基因的调控下自主地死亡，有序结束生命的过程，即程序性细胞死亡[16]。细胞凋亡常出现细胞收缩、出芽小体形成、细胞核固缩、染色质裂解等形态学的变化。细胞凋亡可以清除不良细胞，维持组织内环境稳态[17]。细胞凋亡的信号通路包括内源性凋亡途径、外源性凋亡途径和内质网相关的凋亡途径[18]。Caspase家族贯穿于细胞凋亡的各个时期，在细胞凋亡中起到了关键作用[19]。在内源性凋亡途径中，细胞受到外界凋亡信号的刺激,线粒体膜发生肿胀，通透性增高，Cyto-C、PDCD8、Bitl等凋亡启动因子从线粒体转移至胞质，与Caspase-9及凋亡酶激活因子1结合，形成凋亡体，激活Caspase-9，进一步激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7 等因子，从而启动细胞凋亡程序[20]。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的效应因子，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者，它的活化标志着凋亡进入不可逆的阶段[21]。细胞的凋亡，负调控着肿瘤的发生发展[22]。促使细胞周期停滞和细胞凋亡，是治疗恶性肿瘤的一种靶向方法[23]。本研究结果显示，给予320 μg/mL黄芩苷干预后，细胞凋亡率及Caspase-3、Caspase-9表达水平均升高，提示黄芩苷可诱导A875细胞凋亡，促进Caspase-3、Caspase-9蛋白表达。

综上所述，黄芩苷可以抑制A875细胞增殖，并诱导其凋亡，将A875细胞阻滞于G0/G1期，抑制细胞分裂，机制可能与黄芩苷升高Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平，降低CyclinD1蛋白表达水平有关。