玉郎伞查耳酮下调Cav1.2和RyR2表达抑制氧化应激所致心肌钙超载的效果及作用机制▲

蒙湄方 苏延旭 马兴菊 何 阳 黄仁彬 李映新

(1 广西医科大学药学院，南宁市 530021，电子邮箱:1628936259@qq.com；2 广西医科大学第二附属医院药剂科，南宁市 530007；3 广西中医药大学附属瑞康医院药剂科，南宁市 530011)

玉郎伞为蝶形花科植物疏叶崖豆的干燥块根，广西壮族居民常将其用于治疗原发性高血压、跌打损伤、老年痴呆及产后体虚等[1]。现代药理学研究显示，玉郎伞的主要有效成分为黄酮及多糖，其功效主要包括保肝、降糖、抗肿瘤、抗心肌缺血、提高免疫力等[2]。目前，中药单体的药理药效是研究的热点领域，研究表明，从玉郎伞的总黄酮中提取的17-甲氧基-7-羟基-苯骈呋喃查尔酮[简称玉郎伞查耳酮(Yulangsanchalcone,YLSC)]可以通过抗氧化应激以及抑制细胞凋亡和过度自噬，发挥保护心肌缺血再灌注损伤的作用[4-6]。

目前认为，再灌注后氧化应激所致的心肌细胞钙超载是造成心肌损伤不可逆转的重要因素，因此减轻钙超载保护心肌缺血再灌注损伤成为以钙转运和钙依赖蛋白为干预靶点的药物研究的新思路。本研究主要分析YLSC对过氧化氢引起的心肌细胞内游离钙离子增加的干预作用，并通过测定钙离子通道Cav1.2和雷诺定受体2(ryanodine receptor 2,RyR2)的mRNA表达，初步探讨YLSC抗心肌缺血再灌注的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD乳鼠10只，由广西医科大学动物实验中心提供[动物生产许可证：SYKG(桂)2009-0003；动物使用许可证：SYKG(桂)2009-0005]， 1～3日龄。

1.2 药品和试剂 玉郎伞采自广西灵山县，经广西医科大学生药教研室鉴定为蝶形花科植物疏叶崖豆的干燥块根，参照相关文献[3]中的方法提取YLSC(高效液相色谱法检测，含量≥98%)。杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)-F12、牛血清白蛋白均购自Gibico公司，胎牛血清购自HyClone公司，钙离子荧光探针Fluo-3AM、Pluronic F-127、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)均购自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶购自索莱宝公司，总RNA 提取试剂 RNAiso Plus、反转录试剂和SYBR Green Mix 购自大连TaKaRa 公司，琼脂糖购自西班牙Biowest 公司，上下游引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 主要仪器 YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；250型CO2培养箱(美国SHEL-LAB公司)；FV1000型激光扫描共聚焦系统(日本Olympus公司)；7300型实时荧光定量PCR 仪(美国Applied Biosystems公司)；PowerPac Basic基础电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 心肌细胞的培养 参照文献[7]改进培养方法。无菌条件下取乳鼠心尖组织于HEPES缓冲液中剪碎，加入37 ℃胰酶(0.1%)约10 mL，轻柔吹打消化6～7次(8 min/次)，除第1次消化液弃去外，收集其余消化液并加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培养液终止消化；将所收集消化液用200目筛过滤，4℃下800 r/min 离心5 min，取下层沉淀细胞重悬于培养液中，置于CO2培养箱(5% CO2、95% O2)中37℃下培养1 h后，采用差速贴壁培养法纯化心肌细胞；培养液中加入终浓度为0.1 mmol/L 的BrdU继续培养3～4 d，待细胞融合成片，90%以上细胞有节律同步搏动时用于后续实验。

1.5 氧化损伤模型的建立及细胞内游离钙离子浓度的测定 将心肌细胞随机分为对照组、模型组、100 μmol/L YLSC预处理组和200 μmol/L YLSC预处理组。对照组和模型组加入无血清培养基，YLSC预处理组于无血清培养基中分别加入终浓度为100 μmol/L、200 μmol/L的YLSC，每组设3个平行。各组于培养箱中孵育24 h后弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，加入含5 μmol/L的Fluo-3AM和0.1% Pluronic F-127的磷酸缓冲盐溶负载液，37℃避光温育45 min，用磷酸缓冲盐溶漂洗2～3次，弃去液体，加入无血清低糖DMEM培养液于培养箱中孵育15 min。除对照组外，各组加入30%的过氧化氢溶液60 μL使其终浓度为0.3 mmol/L诱导氧化应激损伤，加入过氧化氢后即刻上机测定。用共聚焦激光扫描系统(激发波长488 nm，发射波长526 nm)每隔15 s 扫描1 次，选定细胞，记录并采集图像，每组选取3个视野动态检测15 min。以平均荧光强度变化反映细胞内游离钙离子的相对水平。实验重复3次。

1.6 Cav1.2和RyR2 mRNA表达情况的检测 细胞分组及预处理同1.5。各组细胞孵育24 h后，除对照组外，各组加入终浓度为0.3 mmol/L的过氧化氢孵育15 min后，按照试剂盒说明书分别提取各组细胞总RNA，以A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0间的合格RNA进行反转录。反转录及荧光定量PCR操作按照试剂盒说明进行：取总RNA 1 μg反转录为 cDNA，取等量的 cDNA用相应的引物以SYBR Green MIX荧光染料进行荧光定量PCR 扩增反应，各基因引物见表1，PCR反应体系包括SYBR Green MIX 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase Free H2O 6 μL。PCR反应条件按 PCR扩增和熔解曲线两步法条件进行反应：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃ 15 s，72℃延伸15 s，共40个循环；最后进行产物熔解曲线测定，从60℃逐渐增温到95℃，时间20 min，95℃ 15 s。以2%的琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物大小。所有PCR均重复3次，每次 3个平行样本。采用2-ΔΔCt法分析各基因在细胞中的相对表达水平。

表1 引物序列

1.7 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，经方差齐性检验提示各组方差齐，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组心肌细胞内游离钙离子 荧光强度的比较 加入过氧化氢即刻，细胞内游离钙离子荧光强度升高，与对照组比较，其他3组15min内的游离钙离子荧光强度均升高，模型组、YLSC低剂量预处理、高剂量预处理组的游离钙离子荧光强度依次降低(均P<0.05)，见表2和图1。

表2 4组心肌细胞内游离钙离子荧光强度的比较(x±s)

图1 4组心肌细胞内游离钙离子荧光强度

2.2 各组心肌细胞 Cav1.2和RyR2的mRNA表达水平的比较 与对照组比较，模型组的Cav1.2和RyR2 mRNA表达水平均增加(P<0.05)；模型组、100 μmol/L YLSC预处理组、200 μmol/L YLSC预处理组的Cav1.2和RyR2 mRNA表达水平依次降低(均P<0.05)。见表3。

表3 4组心肌细胞Cav1.2和RyR2 mRNA相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

钙超载是缺血再灌注损伤的关键机制，钙超载可引起线粒体膜电位降低、组织能量代谢障碍、胞质内磷脂酶和蛋白酶激活等一系列连锁反应，最终导致细胞不可逆性损伤，故钙超载又称为缺血细胞再灌注损伤致死的“最后通路”[8]。氧化应激是引起钙超载的常见因素，氧化性应激使胞内还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值下降，引起膜通道蛋白变构，使钙离子内流增加，从而导致钙超载[9]。过氧化氢可通过产生氧自由基引起细胞氧化应激损伤而导致钙超载，故常用于模拟心肌缺血再灌注损伤及部分与氧自由基密切相关的心血管疾病病理模型[10]。

本研究采用过氧化氢诱导心肌细胞氧化应激损伤，利用Fluo-3AM与细胞内游离钙离子特异性结合后能够被激发荧光，可用激光扫描显微镜进行检测的特点，对心肌细胞内游离钙离子进行测定。结果显示，过氧化氢处理后心肌细胞内的游离钙离子浓度明显升高，表明过氧化氢可以诱导氧化应激引起心肌细胞内钙超载， YLSC预处理组加入过氧化氢后，游离钙离子荧光强度虽然仍较对照组有所增加，但较模型组降低，且有剂量依赖性，说明玉郎伞查尔酮能对抗氧化应激引起的钙超载。

心肌细胞内钙离子浓度与外钙的进入和内钙的释放有关，前者主要通过细胞膜上的L型钙通道进入，后者主要是由肌质网上的RyR通道释放，而心肌细胞上主要分布有RyR2。Cav1.2是心肌细胞L型钙通道中构成钙离子进入细胞的主要孔道结构。Cav1.2的表达升高可增加心肌细胞内的游离钙离子浓度[11]，引发RyR2高亲和位点与钙离子结合，以“以钙释钙”的方式促进钙离子通过RyR2通道从肌浆网释放到胞质中，且RyR2表达增加进一步引起细胞内游离钙离子浓度的增加[12]。本实验结果提示，过氧化氢处理能显著增加心肌细胞L型钙通道Cav1.2和RyR2 通道的mRNA表达量，而玉郎伞查耳酮预处理可下调过氧化氢引起的心肌细胞Cav1.2、RyR2的mRNA表达增加。由此推测， YLSC对抗氧化应激引起的钙超载可能与下调过氧化氢引起的心肌细胞Cav1.2、RyR2的mRNA表达，从而减少外钙的进入和内钙的释放有关。

综上所述，YLSC预处理可抑制氧化应激引起的心肌钙超载，其可能通过下调Cav1.2、RyR2的基因表达，从而抑制心肌细胞内游离钙离子浓度增加。然而基因的表达水平和蛋白表达水平存在不完全一致的现象，因此，下一步还应对Cav1.2、RyR2的蛋白表达进行研究；此外，心肌细胞内的游离钙离子浓度还受到钠-钙交换体、肌浆网钙泵等功能的影响，今后也还需要进行相关研究，才能更好阐明 YLSC的作用机制。