癫痫患者脑脊液和血清P53 mRNA、微小RNA-34a表达情况及其与认知功能的相关性▲

蒋月丽 解龙昌 何超明 庞明武 梁 冬

(1 海南省三亚中心医院/海南省第三人民医院老年医学科，三亚市 572000，电子邮箱：jiangyueli8294@163.com； 2 广州医科大学附属第二医院神经内科，广东省广州市 510260；3 三亚中心医院/海南省第三人民医院神经内科，海南省三亚市 572000)

癫痫是一种慢性脑部疾病，发作时常伴有认知、精神、社会学等诸方面功能障碍，反复性、短暂性是其发病的主要特征[1]。据调查，我国癫痫发病率为4.4%～4.8%，患病对患者心理发育和生活质量产生的影响较大[2]。目前主要以临床资料和发作期的脑电图表现作为癫痫的诊断依据[3]，但早期癫痫病情的评估诊断需要有完整的临床资料、准确且及时的脑电图结果，这使得癫痫诊断的时效性有所下降。因此，寻找一种评估癫痫病情的新指标对诊断癫痫有重要意义。P53基因是一种肿瘤抑制基因，对细胞分裂、增殖起负调控作用，同时可作为转录因子在细胞生长期发挥调控作用[4]。P53基因还参与神经系统疾病如阿尔兹海默病、亨廷顿病等细胞凋亡过程[5]。微小RNA-34a(microRNA-34a，miRNA-34a)普遍存在于真核微生物中，是重要的炎症应答调控基因[6]，且与多种组织、器官、恶性肿瘤的增殖、分化和凋亡有关[7]，还与脑损伤有密切联系[8]。但关于P53、miRNA-34a在癫痫患者中表达情况的研究较少。本研究检测癫痫患者脑脊液和血清中P53、miRNA-34a 的表达水平，探讨二者在癫痫诊断中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年2月至2020年3月于三亚中心医院住院治疗的79例癫痫患者作为癫痫组，选取同期以头痛症状为主，但神经系统体征、脑脊液及相关辅助检查均正常的73例患者作为对照组。癫痫组纳入标准：(1)符合癫痫诊疗指南中的诊断标准[9]；(2)病历资料齐全者；(3)有头颅CT或MRI等神经影像学和脑电图检查结果者；(4)可明确观察到治疗效果且病程在6个月以上者；(5)年龄≥18岁者。排除标准：(1)仅有一次临床发作者；(2)因低血糖或肝、肾等脏器病变引起抽搐的患者；(3)因脑出血、脑肿瘤等引起抽搐的患者；(4)脑电图有痫性放电但临床发作不典型者。对照组的纳入标准：(1)年龄≥18岁；(2)头颅CT、MRI等神经影像学和脑电图检查结果无异常；(3)无低血糖或肝肾等脏器病变。排除标准：(1)依从性较差，无法配合完成指标检测；(2)因个人原因中途退出实验。癫痫组年龄18～54(35.94±8.14)岁，男性41例，女性38例；对照组年龄18～53(36.73±7.35)岁，男性34例，女性39例。两组研究对象的年龄、性别、文化程度差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。本研究所有研究对象均由两名主治及以上职称的医师明确诊断，研究经三亚中心医院医学伦理委员会批准，符合伦理学标准；所有受试对象均由专业人员详细告知研究内容后自愿参加，均签署知情同意书。

表1 两组一般资料的比较

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集：收集两组患者入院前的一般资料，包括性别、年龄、文化程度(低：小学及以下；中：初高中；高：大学及以上)

1.2.2 标本采集：(1)脑脊液，所有研究对象于治疗前接受常规腰椎穿刺取新鲜脑脊液3 mL，室温1 500 r/min离心10 min，取上层清液，置于-80℃保存待测。(2)血清，所有研究对象于治疗前抽取清晨空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80℃保存待测。

1.2.3 脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a表达水平检测：采用实时定量PCR法检测两组脑脊液和血清P53mRNA、miRNA-34a的表达水平。采用RNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司，货号：dp419)分别提取脑脊液和血清总RNA，测定RNA的纯度及浓度，反转录得到cDNA(反转录试剂盒购自上海康朗生物科技有限公司，货号：KL266)。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，采用CFX384型实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)对P53、miRNA-34a进行扩增(qPCR Kit试剂盒购自德国QIAGEN公司，货号：218076)。实时定量PCR反应体系共10μL：cDNA(50 ng/μL)1μL，miScript SYBR® Green Mix 5 μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，ddH2O 3.0 μL。引物由上海生工生物公司合成，序列见表2。P53 实时定量PCR反应条件：95℃，5 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40个循环；72℃，10 min。miRNA-34a 实时定量PCR反应条件：95℃， 5 min； 95℃、 15 s，58℃、 20 s，40个循环；72℃，10 min。采用2-ΔΔCt法对脑脊液和血清P53mRNA、miRNA-34a的相对表达水平进行定量分析。

表2 实时定量PCR引物序列

1.2.3 认知功能评估：采用神经心理学量表对研究对象进行认知功能评估[10]，包括蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment，MoCA)定向力、MoCA命名、MoCA延迟回忆、连线测验A(Trail Making Test A，TMT A)耗时、连线测验B(Trail Making Test B，TMT B)耗时、阿尔茨海默病评估量表认知部分(Alzheimer′s Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale，ADAS-Cog)单词回忆。

1.4 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用成组设计两独立样本t检验或t′检验；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson法分析癫痫患者脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a水平与认知功能的相关性。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平的比较 癫痫组脑脊液P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平及血清P53 mRNA相对表达水平高于对照组，血清miRNA-34a相对表达水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平的比较(x±s)

2.2 两组认知功能的比较 两组MoCA命名得分差异无统计学意义(P>0.05)，癫痫组TMT A耗时、TMT B耗时、ADAS-Cog单词回忆得分高于对照组，MoCA定向力、MoCA延迟回忆得分低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 两组认知功能比较(x±s)

2.3 癫痫患者脑脊液和血清P53 mRNA相对表达水平与miRNA-34a 相对表达水平的相关性 Pearson相关分析结果显示，癫痫患者脑脊液P53 mRNA相对表达水平与脑脊液miRNA-34a相对表达水平呈正相关(r=0.681，P<0.001)，血清P53 mRNA相对表达水平与血清miRNA-34a相对表达水平呈负相关(r=-0.500，P<0.001)。

2.4 癫痫患者脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平与认知功能的相关性 癫痫患者MoCA定向力得分、MoCA延迟回忆得分与脑脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相对表达水平呈负相关(P<0.05)，与血清miRNA-34a相对表达水平呈正相关(P<0.05)；癫痫患者TMT A耗时、 TMT B耗时、ADAS-Cog单词回忆得分与脑脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相对表达水平呈正相关(P<0.05)，与血清miRNA-34a相对表达水平呈负相关(P<0.05)。见表5。

表5 癫痫患者脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平与认知功能的相关性

3 讨 论

癫痫是诸多因素引起大脑神经元异常放电所致的短暂性脑功能失调病，是神经系统常见疾病，发病率和病死率较高[11]，通常可引起患者认知功能损害[12]，给患者及其家庭带来沉重的心理和经济负担，同时对社会产生较多负面影响[13]。癫痫早期诊断主要依靠临床资料和脑电图表现，但这些在临床上的应用有限。寻找新的标志物对癫痫进行早期诊断，有益于寻找合理有效的防治措施，降低癫痫的发病率和死亡率。

P53是基因编码的一种参与细胞凋亡的调节蛋白，在神经元死亡中发挥重要作用[14]。P53基因作为抑癌基因可以对细胞的生长和分化进行调控，且能在一定程度上反映神经元损害程度，从而反应癫痫患者的病情[15]。研究表明，丹酚酸B诱导大鼠癫痫发作几小时后，P53 mRNA在神经元中的表达水平增加，且相关区域有神经元损害[16]。miRNA-34a普遍存在于脊椎动物脑组织内，能通过抑制炎症因子的分泌来缓解炎症反应，同时调节神经系统及神经干细胞的生长发育[17]。miRNA-34a在肿瘤组织中表达下调，具有肿瘤抑制作用[18]。研究表明，颅脑损伤患者脑部神经干细胞增殖过程中miRNA-34a的表达水平下降[19]。李兰[20]检测癫痫患者脑脊液及血清中各种miRNA的水平并分析其对相关炎性因子的调控作用，发现miRNA-34a水平在脑脊液中表达上调而在血清中表达下调，提示miRNA-34a能调节炎性因子并参与神经元功能的改变。本研究结果显示，癫痫组脑脊液中P53 mRNA、miRNA-34a的相对表达水平高于对照组，血清P53 mRNA的相对表达水平高于对照组，但血清miRNA-34a相对表达水平低于对照组(P<0.05)。这提示，在癫痫发病过程中，癫痫患者脑脊液中miRNA-34a的表达水平上升，血清中miRNA-34a表达水平下降，分析原因可能是miRNA-34a从血清中移位进入脑脊液，从而调节脑脊液中炎性因子的表达，进一步影响癫痫的发病过程。而P53无论是在血清还是在脑脊液中都影响神经元细胞凋亡，参与癫痫的发生、发展，因此，癫痫发作时脑脊液和血清的P53 mRNA表达水平上调。相关分析结果显示，癫痫患者脑脊液P53 mRNA相对表达水平与脑脊液miRNA-34a相对表达水平呈正相关，血清P53 mRNA表达水平与血清miRNA-34a相对表达水平呈负相关(P<0.05)。这进一步提示机体通过下调血清中miRNA-34a的表达水平来调节脑组织中炎性因子水平，上调脑脊液和血清中的P53 mRNA表达水平来调节神经元的凋亡情况，两者通过各自的生理机制共同参与癫痫病的发生、发展。

认知功能障碍的发生与癫痫患者大脑结构损害有密切联系，能进一步影响癫痫患者的病情[21]。本研究结果显示，认知功能评定中癫痫组TMT A耗时、TMT B耗时、ADAS-Cog单词回忆得分高于对照组，MoCA定向力、MoCA延迟回忆得分低于对照组；癫痫患者MoCA定向力、MoCA延迟回忆得分与脑脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清中P53 mRNA相对表达水平呈负相关，与血清miRNA-34a相对表达水平呈正相关；癫痫患者TMT A耗时、 TMT B耗时、ADAS-Cog单词回忆得分与脑脊液P53 mRNA、miRNA-34a及血清P53 mRNA相对表达水平呈正相关，与血清miRNA-34a相对表达水平呈负相关(均P<0.05)。这提示脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a相对表达水平与认知功能障碍有关，进一步证明二者与癫痫病情的发展有密切联系，检测脑脊液和血清P53 mRNA、miRNA-34a水平或可作为癫痫诊断或治疗评估的一种方法。

综上所述，P53 mRNA在癫痫患者脑脊液和血清中均呈高表达，miRNA-34a在脑脊液中呈高表达，在血清中呈低表达。认知功能与脑脊液及血清P53 mRNA、miRNA-34a水平均相关。但P53 mRNA、miRNA-34a水平影响癫痫患者病情的具体机制仍未十分明确，且本研究样本数量较小，相关结果还有待进一步深入研究验证。