弓玉祥,倪维杰,倪海锋,张思宇,杨旻宇,陈平圣,*
1东南大学附属中大医院肾脏病研究所,江苏 南京 210009;2东南大学医学院,江苏 南京 210009
脓毒血症是一种由病原菌、创伤、外科感染等因素引起的全身性炎症反应综合征(systemic inflammative reaction syndrome,SIRS),其特点是对感染性损伤的全身炎症反应。这一过程往往导致广泛的组织损伤和多器官功能障碍,而急性肝损伤(acute liver injury,ALI)是其最常见的并发症[1-2]。既往研究表明,内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起急性肝损伤的主要因素[3],LPS 可以显著上调炎性细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),而这些细胞因子会引起严重的肝组织损伤[4-5]。此外,氧化应激也被认为在ALI 的发生发展中起到重要作用[6]。肝脏中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的过量产生会破坏细胞的结构和功能完整性,导致广泛的肝细胞破坏[7]。到目前为止,仍旧缺乏治疗ALI 的有效手段。因此,阐明ALI 的病理机制,是亟待解决的问题。
活性维生素D3(vitamin D3,Vit D3)是一种脂溶性维生素,1,25(OH)2D3是其活性形式[8-9]。研究表明,Vit D3的缺乏与脓毒症的病死率和机械性通气的持续时间显著相关[10-11]。既往研究发现1,25(OH)2D3的生物学效应主要是由维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)介导,VDR 在许多细胞中表达,包括巨噬细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等;而Vit D3 通过VDR 调控细胞增殖、抗炎、抗氧化等信号通路[12]。大量研究证实Vit D3对ALI具有治疗作用,而其潜在机制尚不清楚[13-14]。
因此,本研究旨在阐明Vit D3 对LPS 诱导小鼠ALI的保护机制,为临床治疗ALI提供新思路。
Vit D3(罗盖全J20150011,罗氏公司,美国),LPS(L2630,Sigma 公司,美国)。抗血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抗体(BM4010)、核因子E2 相关因子2(nuclear factor-erythroid 2p45-related factor 2,Nrf2)抗体(PB9290)、抗VDR抗体(BA2877-2)、抗TNF-α抗体(A00002-5)(武汉博士德生物公司);抗NF-κB p65 抗体(8242)、抗IL-1β 抗体(12703)、抗Lamin A/C 抗体(4777)、抗鼠二抗(7076)、抗兔二抗(7074)(Cell Signaling Technology公司,美国);抗NF-κB p50 抗体(ab131546,Abcam公司,美国)。TNF-α ELISA 试剂盒(EK0525,武汉博士德生物),IL-1β ELISA 试剂盒(ab100705,Abcam 公司,美国)。丙二醛测定试剂盒(malondialdehyde,MDA,A003-1-2)、超氧化物歧化酶测定试剂盒(superoxide dismutase,SOD,A001-3-2)、谷胱甘肽S转移酶试剂盒(glutathione S transferase,GST,A004-1-1)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR,A062-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX,A005-1-2)、过氧化氢酶(catalase,CAT,A007-1-1)(南京建成生物工程研究所)。光学显微镜(Olympus BX41)及透射电镜(TEM,HT7700)(Olympus公司,日本)。
6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,体重20~25 g(合格证号:201716345,常州卡文斯实验动物有限公司)。动物饲养于东南大学医学院实验动物中心动物房,温度22~24 ℃,湿度为40%~70%,光照明暗各12 h,换气次数为10~20 次/h。饲料为鼠灭菌饲料,购自东南大学医学院实验动物中心,符合GB-15921.2-2014标准。饮水为经121 ℃、30 min灭菌自来水,由动物经饮水瓶自由摄取。
1.2.1 模型建立及分组
预先配制LPS 浓度为1.0 mg/mL。将40 只雄性C57BL/6 小鼠按体重随机分为对照组、Vit D3 组、模型组(LPS 组)和治疗组(LPS+Vit D3 组),每组10 只。小鼠给予15 mg/kg LPS 腹腔注射建立脓毒血症小鼠ALI模型。造模即刻、造模后8 h、16 h,Vit D3组和LPS+Vit D3组再给予2.5 μg/kg Vit D3灌胃,对照组和LPS组则给予等体积生理盐水灌胃[15]。
1.2.2 标本收集
造模后24 h 处死小鼠。小鼠采用4%水合氯醛腹腔注射麻醉。仰位固定,用一次性注射器(2 mL)心尖取血,室温下3 000 r/min 离心10 min 后取上清液送医院检验科检测肝肾功能,包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(creatinine,Scr)水平。开腹取肝,约2/3 肝固定于4%甲醛溶液中做肝脏病理光镜及免疫组化检查,1/3 肝组织置于-80 ℃冰箱保存备用,另取小块肝组织置于2.5%戊二醛溶液中固定,备电镜检查。
1.2.3 肝脏病理检查
4%甲醛固定的部分肝组织,经清洗、梯度酒精脱水、浸蜡、包埋等步骤后,制成石蜡块;再用切片机切出厚度为4 μm切片,摊片、烤片,后按常规操作行HE染色。光镜下观察肝组织损伤程度和炎症反应。
1.2.4 肝脏电镜检查
小鼠肝脏分离,用生理盐水清洗,切成小块(1 mm3),立即固定在含2.5%戊二醛溶液中,后固定在1%锇酸溶液中。然后,在梯度酒精中连续脱水。用丙酮代替乙醇后,将组织嵌入环氧树脂中并切成超薄切片。切片用醋酸铀和柠檬酸铅双染色,电镜观察。
1.2.5 MDA 水平及SOD、GST、GR、GPX、CAT 活性检测。
将肝组织于冷生理盐水中匀浆,按照厂家提供的实验步骤采用比色法测定MDA 水平和SOD、GST、GR、GPX、CAT活性。
1.2.6 ELISA法检测小鼠血清TNF-α、IL-1β含量
按照厂家提供的步骤采用ELISA 法测定血清TNF-α、IL-1β水平。
1.2.7 免疫组化检测相关蛋白表达
将肝组织石蜡切片经常规脱蜡和复水处理后,用微波法进行抗原修复。以3%过氧化氢甲醇溶液处理切片灭活内源性过氧化物酶后,以10%胎牛血清封阻30 min;分别加入各种一抗,TNF-α抗体(1∶100)及IL-1β抗体(1∶100),孵育过夜;PBS 冲洗3 次,每次3 min,后加入二抗,孵育15 min;PBS冲洗3 次,每次3 min,加入DAB 显色;PBS 冲洗后,以苏木素复染,自然风干后封片观察。
1.2.8 Western blot检测相关蛋白表达
取适量的肝组织,冰上匀浆,使用蛋白提取试剂盒提取蛋白,Bradford 法测定蛋白浓度。每孔上样100 μg蛋白,12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离,将蛋白转移至PVDF 膜上,5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗孵育,4 ℃过夜,次日室温孵育HRP 标记的二抗1 h。化学发光法显示结果,压片曝光,显影定影,采用凝胶成像分析系统拍照,Bio-Rad Quantity one version 4.6.7 软件对相应条带进行灰度分析。
1.2.9 实时荧光定量PCR检测VDR mRNA的水平
取适量的肝组织加入TRIzol 匀浆提取总mRNA,核酸分析仪检测样本中mRNA 的质量;对检测合格的样本进行逆转录;按实时荧光定量试剂盒说明书依次添加试剂后进行扩增,条件为95 ℃30 s;95 ℃5 s,61 ℃31 s,循环40 次;95 ℃15 s,60 ℃60 s,95 ℃15 s。使用2-ΔΔCt法分析所得数据。小鼠VDR引物序列,上游5′-CACAAGACCTACGACC-CCAC-3′,下游5′-CATCATGTCCAGTGAGGGGG-3′。
采用SPSS 20.0统计软件进行分析,实验结果采用均数±标准差()表示,采用单因素方差分析,多个样本之间的两两比较采用Dunnett’st检验,P<0.05为差异有统计学意义。
Vit D3 处理显著改善小鼠的生存率(图1A)。与对照组相比,LPS 组血清ALT 和AST 的水平显著增加(P<0.01,图1B、C)。而Vit D3处理后,这一改变得到逆转。HE 染色被用来评估肝损伤程度。对照组和Vit D3 组肝组织结构完整清晰,而LPS 组的肝组织结构混乱,炎细胞浸润显著增多,而这些变化被Vit D3所抑制(图1D)。Vit D3处理后小鼠的肾功能也得到保护(表1)。
表1 各组小鼠体重及肾功能Table 1 The body weight and kidney function in each group
图1 Vit D3对LPS诱导急性肝损伤血清转氨酶水平及组织病理学改变的影响Figure 1 The effect of Vit D3 on serum transaminase level and histopathological changes in LPS-induced acute liver injury
镜下可以观察到对照组、Vit D3 组肝细胞中正常的线粒体形态,而LPS组线粒体肿胀明显,甚至可以观察到线粒体空泡变性,线粒体嵴消失,Vit D3治疗显著抑制了这些变化(图2A)。进一步对MDA和抗氧化酶活性的检测发现,与对照组和Vit D3 组相比,LPS组MDA水平显著增加(P<0.01),SOD、GST、GR、GPX和CAT的活性显著下降(P<0.01),而这一LPS 诱导的氧化损伤被Vit D3 所逆转(P<0.01,图2B~G)。Nrf2/HO-1 通路在氧化损伤中起到重要作用,进一步研究发现,与LPS 组相比,LPS+Vit D3 组Nrf2和HO-1的表达显著增加(P<0.01,图2H~J)。
图2 Vit D3对LPS诱导急性肝损伤线粒体损伤和氧化应激的影响Figure 2 Effects of Vit D3 on mitochondrial injury and oxidative stress induced by LPS in acute liver injury
炎性细胞因子,如TNF-α、IL-1β在LPS 诱导的ALI起到关键作用。与LPS组相比,血清TNF-α和IL-1β的水平在Vit D3 处理后显著下调(P<0.01,图3A、B),而肝组织中TNF-α和IL-1β的蛋白水平与血清中一致(图3C~F)。结果显示,在LPS处理后,肝组织中NF-κB p65和p50显著升高(P<0.01),而Vit D3处理逆转了这一改变(P<0.01,图3G~I)。
图3 Vit D3对LPS诱导急性肝损伤炎症反应的影响Figure 3 Effects of Vit D3 on LPS-induced acute liver injury
如前文所述,Vit D3 主要通过VDR 发挥作用,因此进一步探究了VDR 的表达水平。与对照组相比,LPS 组VDR 表达显著减少(P<0.01),Vit D3 处理后,VDR表达水平上调(P<0.01,图4)。
图4 各组小鼠肝组织中VDR表达比较Figure 4 Comparison of VDR expression in liver tissues of mice in each group
ALI是一种病死率高、危及生命的临床综合征[1]。Vit D3 具有多种药理作用,例如抗氧化、抗炎等[16]。本研究揭示了Vit D3对LPS诱导的ALI具有保护作用,Vit D3处理可以显著改善LPS诱导的肝损伤,减少氧化应激,降低炎症水平。这些发现表明Vit D3是一种有吸引力的治疗ALI的药物。
LPS 是革兰阴性细菌所分泌内毒素的主要成分,可通过刺激包括巨噬细胞在内的免疫细胞释放炎症因子,从而使肝细胞发生凋亡与坏死,LPS诱导的ALI 动物模型被广泛使用,用于探讨和评价肝保护剂的疗效[17-18]。本研究中LPS注射导致小鼠血清ALT和AST水平升高,肝脏发生病理改变,提示LPS引起了肝脏损伤。与此同时,Vit D3 处理显著降低了血清AST 和ALT 水平,缓解了系统炎症水平,抑制了肝脏氧化损伤和炎症。同时本研究发现,Vit D3处理后,Scr和BUN水平显著下降,这与之前的研究一致,说明了Vit D3 对LPS 诱导的急性肾损伤具有显著的保护作用[15]。这些结果表明,Vit D3 的保护机制可能并非是器官特异性的,而是涉及不同器官间广泛存在的抗损伤通路。
肝损伤的发生与炎症细胞因子的产生密切相关,既往研究表明,LPS诱导的肝损伤涉及炎症反应[19]。LPS 激活炎症细胞,如Kupffer 细胞等,释放过量的促炎细胞因子,如TNF-α 和IL-1β,而这些促炎细胞因子的释放是触发炎症反应的关键步骤[20-21]。因此,本研究测定了血清和肝脏组织中TNF-α 和IL-1β 的水平,结果显示Vit D3 明显抑制LPS 诱导的TNF-α 和IL-1β上调。
NF-κB广泛参与了炎症反应,一旦被LPS激活,IκB 磷酸化和降解,释放NF-κB 进入细胞核调节TNF-α等炎性细胞因子的表达。最近的一项研究证实,NF-κB 通路在LPS 诱导ALI 中起到重要作用[15]。因此,我们研究了Vit D3 对NF-κB 激活的影响。结果表明,服用Vit D3显著抑制了NF-κB p65和p50蛋白的表达,从而提示Vit D3 对ALI 的炎症抑制可能是通过抑制NF-κB通路实现的。
氧化应激引起的ROS 产生和线粒体功能障碍是LPS 诱导ALI 的另一可能机制[22]。氧化应激被认为在ALI 的发展过程中发挥了重要的病理生理作用[23]。既往研究证实,Nrf2 在诱导抗氧化酶如SOD、GST、GR、GPX、CAT对抗氧化应激中发挥重要作用,同样的,HO-1的表达受转录因子Nrf2控制,近期研究表明Nrf2信号通路在LPS诱导的ALI中发挥保护作用[24-25]。本研究结果显示,Vit D3增加了Nrf2和HO-1 的表达,降低了肝组织MDA 水平,提高了SOD、GST、GR、CAT和GPX等酶的活性,减轻了LPS诱导的肝脏线粒体损伤。
本研究结果揭示了,在LPS诱导的ALI模型中,Vit D3具有抗氧化和抗炎作用,然而其潜在机制尚不清楚。众所周知,Vit D3的效用主要由VDR介导[10],而研究表明,VDR在炎症和氧化应激调控中发挥重要作用。据此我们推测,在LPS诱导的ALI中,Vit D3的保护作用主要是由VDR 介导的。本研究结果提示,与对照组相比,LPS 组肝组织中VDR 的蛋白表达显著下降,Vit D3处理后,VDR表达明显上调。因此,本研究初步证实了使用Vit D3 是治疗ALI 行之有效的办法,并且从炎症和氧化应激两个方面初步解析了其作用机制。
综上所述,Vit D3 能显著抑制血清中ALT 和AST 的水平,并能显著抑制组织病理学改变,此外,Vit D3 可以抑制氧化应激和炎症,而这一效果可能由VDR 通路介导。这些结果都表明,Vit D3可能成为治疗急性脓毒血症肝损伤的候选药物。