凋亡抑制蛋白c-FLIP（L）调控肺纤维化过程的机制

李 昊，张林凯，张 晶

南京大学生命科学学院，江苏 南京 210023

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是困扰人类的一种顽症，被定义为一种病因不明、发病机制不清的弥散性肺间质疾病［1］。近年来，肺纤维化在国内外的发病率呈显著上升趋势，已成为全球范围内关注的健康问题。IPF预后差，患者5年存活率仅为20%，目前尚无治愈方法［2］。目前认为肺纤维化的发展主要分为2 个阶段：①早期肺泡炎症阶段，肺部浸润细胞和间质细胞会分泌一系列细胞因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、趋化因子CXC 等，促进炎性细胞进一步聚集；②后期纤维化阶段，活化的间质细胞（成纤维细胞和成肌纤维细胞）及炎症细胞会分泌生长因子［如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）］和白细胞介素（interleukin，IL）等参与肺组织重构，导致肺纤维化的发生。

TGF-β被认为是肺纤维化进程中最重要的细胞因子，作为关键性的致纤维化因子参与肺纤维化的损伤和修复过程，并且它能诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化。研究发现，上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是肺纤维化发病机制中的一个关键步骤，肺上皮细胞发生EMT转化为成纤维样细胞是导致肺纤维化的重要原因［3］。文献报道在IPF 患者的肺组织中检测到c-FLIP（L）蛋白的异常表达［4-5］。c-FLIP（L）具有caspase-8 类似结构，由DED 结构域和caspase 样结构域组成，是一个无活性的蛋白酶样蛋白质。c-FLIP（L）作为caspase-8的抑制因子，能有效抑制死亡受体家族（death receptor，DR）介导的细胞凋亡［6］。除了抗凋亡功能外，c-FLIP（L）还被报道参与了EMT介导的肿瘤细胞迁移与转移，如在人非小细胞肺癌细胞中，TNF-α和TGF-β信号能够上调c-FLIP（L）表达，与细胞迁移密切相关［7］，黑色素瘤B16F10 细胞中c-FLIP（L）高表达促进EMT 关键分子Snail 表达，增强细胞运动［8］，以及环状RNAcircPVT1 调控c-FLIP 表达，能增强EMT诱导骨肉瘤的侵袭转移［9］。

在肺纤维化过程中，c-FLIP（L）表达水平的变化影响了肺泡上皮细胞对凋亡的敏感性，那么它的表达是否还会影响肺上皮细胞发生EMT，成为肺纤维化发展的一个诱因呢？这是探究肺纤维化可能发病机制的新切入点，为靶向EMT的肺纤维化治疗提供新的潜在靶点。本研究通过建立博来霉素（bleomycin，BLM）诱导的肺纤维化模型，探讨c-FLIP（L）表达与EMT发生及肺纤维化的相关性。

1 材料和方法

1.1 材料

C57BL/6 小鼠，8 周龄，雄性（体重18～20 g），健康SPF级，购于南京大学模式动物研究所。人源肺癌上皮细胞株A549购自美国ATCC。FLIP-A549稳定表达细胞株为实验室保存。

戊巴比妥钠（上海生工公司），BLM（化药株氏会社，日本），Masson 染色试剂盒（福州迈新生物科技有限公司）；FLIP 抗体（3210s，C Signaling TechnologyTM）、Vimentin 抗体（BD 550513，BD PharmingenTM）和E-Cadherin 抗体（#610181，BD PharmingenTM）（上海优宁维生物科技股份有限公司）；Smad-luc报告基因（上海吉满生物科技公司）；FLIP siRNA（5′-GCAGUCUGUUCAAGGAGCATT-3′）（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BLM诱导小鼠肺纤维化模型的建立及鉴定

C57BL/6小鼠采用随机法分为对照组、BLM组，每组6 只。各组小鼠腹腔注射50 μL 的3%戊巴比妥钠进行麻醉，仰卧固定在实验台上，将颈部皮肤钝性分离暴露出气管。注射针头沿气管轻轻注入0.1 mL BLM（2.5 mg/kg），对照组注入等量生理盐水，注射完成后采用医用缝合线进行气管及周围皮肤的缝合。造模后28 d 处死小鼠，取肺组织置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，按试剂盒说明进行Masson染色及HE染色，显微镜观察肺组织结构。

1.2.2 免疫组化染色

肺组织石蜡切片经60 ℃烤片、常规脱蜡，抗原修复，3%H2O2室温孵育15 min 等操作后进行封闭，3%山羊血清室温封闭30 min后，每张切片滴加适当浓度的一抗溶液50 μL，4 ℃过夜。次日，将切片PBST 漂洗5 min×3 次，滴加50 μL 聚合物增强剂（A剂），室温30 min后PBST漂洗5 min×3次。然后，滴加预备好的显色剂DAB 工作液50 μL 观察显色，用流水冲洗终止显色。最后，切片进行分化、脱水、透明等一系列处理后，滴入中性树脂进行固定封片，光学观察拍照。

1.2.3 Western blot分析

收集细胞样品收集细胞用预冷PBS 洗两次，加入RIPA 液（P0013，上海碧云天生物技术公司）裂解细胞，冰上放置20 min 后12 000 r/min离心10 min，收集上清。蛋白质定量后加入上样缓冲液煮沸5 min。取适量点样进行10% SDS-PAGE 凝胶电泳及转膜。样品膜进行5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，包被一抗溶液4 ℃过夜。次日PBST 洗膜5 min×4 次，包被二抗溶液室温1 h，PBST 洗涤后滴加化学发光反应液，采用蛋白分析仪拍摄后进行结果分析。

1.2.4 Q-PCR分析

收取细胞，采用TRIzol法提取RNA，使用TaKaRa逆转录试剂盒（北京宝日医生物技术公司）获得DNA。根据实验需要，取适量上述逆转录后的cDNA 配制20 μL 体系，使用Real-time PCR 仪进行PCR 扩增，采用Quantitation-comparative CT（Livak）法即ΔΔCT法测定进行数据分析。所有Q-PCR 引物购于南京金斯瑞公司。E-cadherin引物：上游5′-TGCACCAACCCTCATGAGTG-3′和下游5′-GTCAGTATCAGCCGCTTTCAG-3′；N-cadherin引物：上游5′-GTCAGTATCAGCCGCTTTCAG-3′和 下 游5′-ATTGATGCTGACGATCCCAATGCC-3′；Vimentin 引物：上游5′-TCAAGTCCAGCTGCCACTGTGATCA-3′和下游5′-TGCAGGCTCAGATTCAGGA-3′；GAPDH 引物：上游5′-GAGCAGGTCTTGGTATTCACG-3′和下游5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′。

1.2.5 Smad报告基因检测

A549 细胞接种于24 孔板，次日转染质粒DNA（含Smad-luc 报告基因质粒和pRL 质粒），24 h 后采用TGF-β1（10 ng/mL）处理12 h，吸弃培养液，PBS漂洗1次，然后每孔加入50 μL passive lysis buffer 裂解20 min，细胞裂解液转入EP管4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清，采用双荧光素酶试剂盒（E1910，Promega 公司，美国），按说明书操作，上样测定荧光素酶的活性。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0 软件进行结果分析，数据用均数±标准差（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-FLIP（L）在肺纤维化中高表达与EMT相关

采用BLM构建小鼠肺纤维化模型，造模28 d后处死小鼠，制备肺组织切片进行HE 染色和Masson染色（图1）。HE 染色显示对照组肺泡结构呈现网孔状分布，而BLM 组中肺泡结构遭到严重破坏，肺泡数量减少，形态不规则。Masson染色显示胶原沉积，它是成纤维细胞增生的指标。对照组Masson染色肺组织结构清晰，肺泡间隔未见增厚和纤维化表现，BLM 组肺组织中可见大量胶原沉积，肺纤维化严重，说明造模成功。

图1 BLM构建肺纤维化模型的鉴定（×200）Figure 1 Identification of pulmonary fibrosis model constructed by BLM（×200）

E-Cadherin 是EMT 的特异性上皮标志物，主要表达在肺泡上皮细胞表面。采用免疫组化染色来验证c-FLIP（L）表达是否参与纤维化病程中EMT的发生。免疫组化染色结果显示，E-Cadherin 在正常肺泡上皮细胞和柱状气管上皮细胞中大量表达，BLM 组纤维化的肺组织中E-cadherin 表达下调，而c-FLIP（L）染色结果与E-cadhesin变化相反，肺纤维化组织中c-FLIP（L）表达升高，并且在其相应深染位置上E-cadherin表现为低表达（图2A）。定量分析显示，BLM组与对照组比较，E-cadherin下调以及c-FLIP（L）上调，差异都有统计学意义（P＜0.01，n=3，图2B），这些关联提示c-FLIP（L）高表达参与肺纤维化过程中EMT的发生。

图2 免疫组化染色观察E-Cadherin及c-FLIP的表达分布Figure 2 Expression and distribution of E-Cadherin and c-FLIP observed by immunohistochemical staining

2.2 C-FLIP（L）高表达促进细胞EMT表型

为了确定c-FLIP（L）表达参与肺上皮细胞EMT的发生，在细胞水平上采用肺癌上皮细胞株A549为背景构建c-FLIP-A549 稳定表达株，对其细胞形态学进行观察。与空载质粒构建的对照组相比，c-FLIP-A549稳定株#1和#2细胞偏长梭形，细胞间黏附减少，显示出类EMT 现象（图3A），其c-FLIP（L）表达水平升高（图3B）。进一步对EMT 标志分子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 进行qRT-PCR 检测，结果显示c-FLIP-A549 稳定株中E-cadherin mRNA 表达下调而N-cadherin mRNA 表达上调（P＜0.001，n=3），Vimentin mRNA 相应升高（P＜0.05，n=3，图3C）。这些标志物的变化说明c-FLIP（L）高表达能促进EMT发生。

图3 c-FLIP（L）高表达能促进细胞发生EMT现象Figure 3 Overexpresion of c-FLIP（L）promotes EMT-like phenotype

2.3 c-FLIP（L）调控TGF-β1诱导的EMT

采用TGF-β1 诱导A549 细胞EMT 发生，检测c-FLIP（L）高表达对TGF-β1 诱导EMT 过程的影响。Smads 是细胞内重要的TGF-β1 信号转导和调节分子，报告质粒Smad-luc 的luciferase 活性反映Smad 通路的激活状态。在TGF-β1 刺激下，c-FLIP（L）过表达细胞表现出更强的luciferase 活性（P＜0.05，n=3，图4），说明Smad通路的激活程度高，表明c-FLIP表达能促进TGF-β1诱导的Smad信号通路的激活。

图4 c-FLIP（L）过表达增强TGF-β1诱导Smad通路的激活Figure 4 c-FLIP（L）enhances the activation of Smad pathway induced by TGF-β1

为了进一步验证c-FLIP（L）调控EMT 发生，采用c-FLIP siRNA 干扰片段敲减内源性c-FLIP（L）的表达，结果显示FLIP-2 siRNA 干扰片段能有效敲减内源性c-FLIP（L）的表达水平（图5A）。接着，采用FLIP-2 siRNA 转染A549 细胞培养24 h 后，加入20 ng/mL TGF-β1 诱导细胞EMT 发生，Western blot检测EMT 标志蛋白表达变化。对照组NC siRNA中TGF-β1诱导的E-cadherin表达显著下调及Vimentin表达水平上升（P＜0.001，n=3，图5B），而FLIP-2 siRNA 有效抑制了TGF-β1 诱导的EMT 现象，抑制了E-cadherin 蛋白水平的下调，也减弱了Vimentin表达水平的上调，说明下调c-FLIP（L）表达水平能阻滞EMT的进程。

图5 敲减c-FLIP（L）能够阻滞TGF-β1诱导的EMT发生Figure 5 Knockdown of c-FLIP（L）inhibits the process of EMT induced by TGF-β1

3 讨论

越来越多的数据表明，在肺纤维化发展中，EMT是成纤维细胞/肌成纤维细胞的一个重要来源［2］。来源于肺组织的上皮细胞进行体外培养时，在促纤维化因子TGF-β1的诱导下能够转化成间质细胞［10］。肺纤维化组织中TGF-β1高表达不仅能促进EMT发生，还能促进成纤维细胞过度增殖和分化，因此，TGF-β1是肺纤维化发生的关键因子。另有研究表明，炎性因子TNF-α能够促进TGF-β1诱导的EMT发展［11］，但其作用机制并不清楚。本研究发现c-FLIP（L）能够促进TGF-β1诱导的EMT 发生，而c-FLIP（L）是NF-κB 的靶基因，能被TNF-α诱导上调，这一发现为TNF-α促TGF-β1 诱导EMT 发生提供了可能的分子机制。肺纤维化发展的早期是肺泡炎症，肺部浸润细胞和间质细胞分泌的主要细胞因子是TNF-α，在IPF患者的肺组织中检测到c-FLIP（L）蛋白的异常表达［4-5］，综合这些报道，推测在肺纤维化过程中c-FLIP 高表达与EMT发生密切相关，是调控肺纤维化发展的重要诱因之一。

虽然C-FLIP（L）是重要的一种抗凋亡蛋白，但具有多种生物学功能。我们前期研究报道了c-FLIP（L）能够进入细胞核参与AP-1 转录活性调控［13］。而文献报道AP-1家庭成员c-Jun可以导致上皮细胞极性缺失，c-Fos 可降低细胞间的粘连，JunD 活性影响MMP 表达，这些都与EMT 关系密切［14］。此外，我们还发现c-FLIP（L）能进入胞核参与catenin/TCF 转录复合物调控β-catenin下游靶基因的表达［15］，而TGFβ1 信号能激活Wnt/catenin 通路与Smad 通路产生crosstalk促进EMT转化［16］。这些发现都为c-FLIP参与EMT发生提供了有力依据。

在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中，肺组织切片的免疫组化分析显示c-FLIP（L）高表达与E-cadherin 低表达呈负相关，提示c-FLIP（L）参与了肺纤维化过程中的EMT发生。在细胞水平，进一步实验证明c-FLIP（L）高表达能够增强TGF-β1 诱导的EMT进程。尽管c-FLIP（L）调控EMT的作用机制以及参与肺纤维化的作用机制还有待阐明，但本研究提出了肺纤维化中c-FLIP（L）的异常表达可能是IPF 治疗的潜在靶点，从新的角度探究肺纤维化的发病机制，靶向EMT调控为缓解肺纤维化疾病进展提供新的可能途径。