橙皮素与铁蛋白的共价相互作用及其对铁蛋白理化性质的影响

陈盛楠，刘玉茜，刘梦肴，孙冀萱，杨 瑞*

（食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

铁蛋白是一种广泛存在于动物、植物和微生物中的铁存储蛋白[1]，是由24 个亚基对称组成的一个球状分子。其内径为8 nm，外径为12 nm[2]。铁蛋白亚基围绕形成12 个二重轴通道、8 个三重轴通道和6 个四重轴通道[3]，这些通道被认为是小分子物质进出铁蛋白的媒介[4]。铁蛋白能够在其内部空腔存储可溶的、无毒的、生物可利用的Fe3+并调控细胞内铁代谢平衡，是开发补铁制剂的良好原料[1]。因此铁蛋白在食品、药品、保健品方面具有广泛的应用前景。然而，铁蛋白在食品加工环境中（例如热、氧、pH值）不够稳定进而破坏其结构，从而影响蛋白质的应用。

利用食品天然组分（如多酚类物质）构建蛋白质-多酚复合物是提高蛋白质稳定性的良好途径。蛋白质和多酚的结合包括共价[5]和非共价[6]2 种结合方式。非共价相互作用主要是指蛋白质和多酚以氢键、范德华力、疏水作用等方式结合[7-9]。蛋白质和多酚共价结合的方式主要包括酶促反应[10]和非酶促反应[11-12]。通常，共价相互作用相对于非共价相互作用表现出更强的作用力[13]。非酶促反应的共价相互作用一般发生在氧气存在条件下的碱性溶液中，多酚被氧化成醌后，可与蛋白质侧链上的氨基酸残基（色氨酸、赖氨酸、半胱氨酸）生成稳定的化学键进而形成蛋白质-多酚共价复合物[14-15]。目前，麦醇溶蛋白、南瓜种子蛋白分离物已被报道可与多酚进行共价结合进而影响蛋白质的理化性质[16-17]。橙皮素（5,7,30-三羟基-40-甲氧基黄烷酮）是在柑橘类水果中常见的一种天然黄酮化合物。橙皮素是橙皮苷的糖基配体，其结构中含有酮羰基、醚基、甲氧基以及多个酚羟基，使其具有较为广泛的药理作用，例如抗氧化、抗癌、增强免疫力等[18]，被广泛应用于食品、药品、化妆品等多个领域。

本研究以铁蛋白和橙皮素为材料，通过碱处理制备铁蛋白-橙皮素共价复合物。采用荧光光谱研究不同浓度橙皮素与铁蛋白的结合程度，并揭示复合物的结构变化；采用溶解度、Zeta电位、热重、氧化沉淀和还原释放等指标考察橙皮素对铁蛋白理化性质的影响。这项研究将有助于改善铁蛋白的理化性质，并且可在功能食品和制药工业中拓展新的应用方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橙皮素 美国Sigma-Aldrich公司；乙醇（分析纯）天津市江天化工技术有限公司；过硫氨酸、甘氨酸、福林-酚 北京索莱宝生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇和考马斯亮蓝R250 中国国药控股有限公司；电泳标记 美国GE Healthcare Bio-Sciences AB公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器有限公司；FG2 pH计 美国Mettler-Toledo公司；ZWJ-2102C恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；VE180电泳槽 天能电池集团股份有限公司；Zetaizer Nano ZS90激光粒度仪 英国马尔文公司；Cary Eclipse荧光分光光度计、8453紫外分光光度计 美国安捷伦公司；UV 3600 Plus紫外-可见近红外分光光度计 日本岛津公司；TGA-Q50型热重分析仪 美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1 铁蛋白的提取与纯化

根据已报道的方法[19]，制备由大肠杆菌BL21菌株表达的重组大豆种子H-2亚基铁蛋白（recombinant soybean seed H-2 subunit ferritin，rH-2），其与大豆种子铁蛋白的H-2型亚基具有相似的氨基酸分布，制备的铁蛋白内部空腔不含有铁离子，是缺铁的铁蛋白。

1.3.2 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

通过SDS-PAGE检验分离纯化后的铁蛋白纯度和分子质量。电泳在15 mA恒流条件下进行，完成后使用考马斯亮蓝R-250进行染色。

1.3.3 铁蛋白-橙皮素共价复合物的制备

按照已报道的方法制备橙皮素共价修饰的铁蛋白[20]。将橙皮素（0.03 g）溶于体积分数70%的乙醇溶液（10 mL）中，并磁力搅拌25 min以制备储备溶液。用NaOH（0.1 mol/L）溶液将铁蛋白溶液的pH值调节至9.0。将橙皮素溶液稀释并与4 组铁蛋白样品混合，使物质的量比为40∶1、80∶1、120∶1或160∶1（橙皮素/铁蛋白）。上述4 种溶液中乙醇的最终体积分数分别为0.14%、0.28%、0.42%和0.56%。这些低体积分数的乙醇不会破坏铁蛋白的稳定性。将这些混合物的pH值重新调节至9.0，然后用搅拌器在25 ℃充分混合24 h（暴露于空气中）。将叠氮化钠（0.2 g/L）添加到混合物中以防止微生物生长。最后将混合物用去离子水（pH 7.0）透析（截留分子质量为10 kDa）48 h，变化间隔为6 h，以确保未反应的游离橙皮素被完全透析出去。收集液体并命名为铁蛋白-橙皮素共价复合物。由于铁蛋白空腔中无铁离子，在铁蛋白-橙皮素共价复合物的形成及贮存过程中是没有铁离子参与的，避免了铁离子的氧化作用对复合物的破坏。

1.3.4 荧光光谱分析

使用荧光分光光度计对铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物（0.25 μmol/L，1.5 mL）进行荧光光谱分析。激发缝和发射缝分别为5 nm和10 nm。激发波长为290 nm，并且在300～500 nm的范围内收集扫描发射光谱。

1.3.5 溶解性分析

利用1 mol/L的盐酸和氢氧化钠调节铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物（0.5 μmol/L）的pH值（2～11），然后4 ℃、10 000 r/min离心15 min。取上清液采用考马斯亮蓝法[21]测定蛋白质的含量，以牛血清蛋白为标准物绘制标准曲线，铁蛋白和铁蛋白-橙皮素复合物的溶解度表示为上清液蛋白浓度占总蛋白浓度的百分比[22]。

1.3.6 Zeta电位分析

使用激光粒度仪分析样品的Zeta电位。将铁蛋白-橙皮素共价复合物、铁蛋白（0.5 μmol/L）分别调节至不同pH值（4.0、5.0、5.5、6.0和7.0），在25 ℃条件下通过Zeta电位分析仪运行6 次。每个样品进行3 次平行实验，数据结果取平均值。

1.3.7 铁蛋白的铁氧化沉积分析

通过向缺铁铁蛋白体系（0.5 μmol/L）添加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最终Fe2+浓度为48 μmol/L，根据报道的方法分析铁的氧化沉积性质[23]。使用紫外-可见近红外分光光度计，通过记录25 ℃条件下波长300 nm的吸光度进行测量。在90 s内记录铁的氧化动力学，根据报道的方法测量铁的初始氧化速率[23]。

1.3.8 铁蛋白的铁还原释放分析

通过向铁蛋白样品溶液（0.5 μmol/L，pH 7.0）中以20 min间隔逐渐加Fe2+（FeSO4，HCl酸性水溶解，pH 2.0），使最终Fe2+浓度为300 μmol/L，制备载铁铁蛋白。载铁铁蛋白释放铁的方法如下：每个反应体系（1 mL）包含0.5 μmol/L铁蛋白-橙皮素共价复合物，500 μmol/L菲洛嗪（ferrozine）。通过加入抗坏血酸（1 mmol/L）引发铁还原释放反应。通过记录波长562 nm处吸光度的增加测量[Fe(ferrozine)3]2+的形成，并按摩尔吸光系数ε562为27.9 L/（mmol•cm）测量铁的释放[24]，并计算铁释放的初始速率（v0）。

1.3.9 热重分析

使用热重分析技术对铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物进行热分析。将冻干的粉末状样品（3.5 mg）放入铝锅中称质量，然后放入热重分析仪中。空铝锅为对照。实验过程中，氮气以10 ℃/min的升温速率在50～600 ℃的温度下，对不同样品进行热重测量。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 铁蛋白的制备

本研究使用重组大豆rH-2铁蛋白作为铁蛋白原料，它与天然H-2型大豆种子铁蛋白的氨基酸序列高度相似，且更易于获取[19]。将纯化后的铁蛋白通过SDS-PAGE确定其亚基分子质量，SDS-PAGE结果显示它由一个分子质量28.0 kDa的亚基组成（图1），与文献[25]报道一致。因此，纯化后的铁蛋白符合实验要求。

图1 铁蛋白纯化后的电泳图Fig.1 SDS-PAGE profile of purified ferritin

2.2 铁蛋白-橙皮素共价复合物的荧光分析

每个铁蛋白亚基的E螺旋上都有1 个色氨酸残基[3]，可用于分析铁蛋白的荧光变化。与对照铁蛋白相比，荧光光谱中所有共价复合物的强度均显著降低（图2），这表明橙皮素的结合影响铁蛋白的结构。随着橙皮素含量的增加（物质的量比40∶1～160∶1），形成的共价复合物的荧光强度逐渐降低。随着反应体系中橙皮素含量增加（物质的量比80∶1～160∶1），响应值的变化并不显著。因此橙皮素与铁蛋白的反应在80∶1比例可能达到饱和。另外，铁蛋白-橙皮素共价复合物（物质的量比40∶1）的荧光光谱相对对照铁蛋白红移了约6 nm，铁蛋白-橙皮素共价复合物（物质的量比80∶1～160∶1）的发射光谱相对于对照铁蛋白红移了约10 nm。该现象表明共价结合可能导致更多的铁蛋白侧链暴露于溶液中[26]，这会使色氨酸移至更亲水的环境，因此通过橙皮素的共价修饰，铁蛋白-橙皮素共价复合物的结构发生了改变。本研究选用80∶1比例（橙皮素/铁蛋白）的铁蛋白-橙皮素复合产物进行后续实验研究。

图2 铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物的荧光光谱分析Fig.2 Fluorescence spectra of ferritin and its complexes with hesperetin at different molar ratios

2.3 溶解度分析

如图3所示，在pH 2～6范围内，铁蛋白-橙皮素共价复合物与对照铁蛋白相比会有相对较低的水溶性（P＜0.05），在pH 7～11范围内，铁蛋白-橙皮素共价复合物的溶解度提高并且与对照蛋白相比差异不显著（P＞0.05）。该发现与Rawel等[27]报道类似，其发现乳清蛋白和槲皮素共价结合后，复合物的溶解度降低。不同的是，Wei Zihao等[13]提出乳蛋白和-表没食子儿茶素没食子酸酯共价结合会提高乳蛋白的水溶性。因此，推断小分子化合物的溶解性可能影响其结合后形成的复合物的溶解性。本研究中，疏水性橙皮素的结合在不同pH值范围内表现出不同的作用，在pH 7～11范围内，铁蛋白-橙皮素共价复合物的溶解度表现与对照蛋白类似。因植物铁蛋白本身溶解性良好，复合物溶解度的维持可为其在水性食品形式（如饮料）中的应用提供理论基础。

图3 铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物的溶解度Fig.3 Solubility of ferritin and hesperetin-ferritin complex at a molar ratio of 80:1

2.4 Zeta电位分析

如图4所示，铁蛋白溶液的Zeta电位在低pH值时（＜5.25）表现为带正电荷，高pH值时（＞5.25）表现为带负电荷，零电荷点出现在pH 5.25左右。不同的是，橙皮素共价结合后铁蛋白-橙皮素共价复合物的Zeta电位变化明显。零电荷点出现在pH 4.8左右。此结果证明了橙皮素的结合可以显著降低铁蛋白的等电点。复合物等电点的降低有利于扩展其在酸性食品和饮料中的应用。

图4 铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物的Zeta电位Fig.4 Zeta potentials of ferritin and hesperetin-ferritin complex

2.5 铁的氧化沉淀分析

铁蛋白的氧化沉淀活性是指铁蛋白利用其氧化位点可将Fe2+在氧存在条件下氧化成Fe3+的过程，生成的Fe3+可以被运输并贮藏于铁蛋白的空腔结构中。本研究利用波长300 nm处的紫外吸收监测铁蛋白铁氧化沉淀过程中Fe3+的形成[28]。实验选用96 Fe2+/铁蛋白体系，结果发现对照铁蛋白最初以22.50 μmol/s的速率催化Fe2+的氧化（图5）。不同的是，铁蛋白-橙皮素共价复合物的Fe2+氧化初始速率为32.36 μmol/s，显著高于对照组（P＜0.05）。因此，橙皮素在铁蛋白上的结合促进了铁蛋白的铁氧化沉淀活性。铁蛋白的铁氧化位点通常位于其亲水性3 倍轴通道上，该通道被认为是铁离子通过蛋白质外壳进入内部的途径[29]，橙皮素的结合可能影响了铁蛋白3 倍轴通道的结构，进而一定程度上促进了铁离子的氧化。在铁离子的代谢过程中，机体过量的Fe2+水平会产生毒副作用，表现为其能够诱发产生很强氧化能力的羟自由基，易造成细胞损伤甚至死亡。橙皮素对铁蛋白的共价修饰作用促进了铁离子的氧化，该作用可能会对减轻铁离子的毒副作用具有重要意义。

图5 铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物进行Fe2＋氧化的时间过程Fig.5 Time course of ferrous iron oxidation with ferritin or hesperetinferritin complex

2.6 铁的还原释放分析

铁蛋白的还原释放是指铁蛋白在还原剂存在的情况下，将贮藏于铁蛋白内部空腔内的Fe3+还原为Fe2+，随后将Fe2+释放于外部环境当中。实验选用600 Fe2+/铁蛋白体系，铁蛋白释放出来的Fe2+与螯合剂ferrozine可以形成螯合物[Fe(ferrozine)3]2+，该螯合物在波长562 nm条件下有很强的吸光度，因此可以用于检测还原释放过程。与氧化沉积途径不同，植物铁蛋白的4 倍轴通道通常可作为植物铁蛋白铁释放的途径[30]。结果显示铁蛋白-橙皮素共价复合物的Fe2+释放初始速率为4.31 nmol/s，显著低于铁蛋白的5.52 nmol/s（P＜0.05）（图6）。因此，橙皮素的结合显著降低了铁蛋白的铁还原释放能力。其可能是由于橙皮素结合在铁蛋白外表面引起铁蛋白结构变化导致的。

图6 1 mmol/L抗坏血酸诱导铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物释放Fe2＋的动力学Fig.6 Kinetics of Fe2＋ release from ferritin and hesperetin-ferritin complex induced by 1 mmol/L ascorbic acid

2.7 热重分析

蛋白质分解分为3 个阶段，第1阶段为水分蒸发阶段，这一阶段质量损失较少，且渐渐趋于平稳；第2阶段为质量快速分解阶段，大部分的蛋白质在此阶段经高温快速分解，此阶段质量损失较快；第3阶段为质量缓慢损失阶段[31]。由图7A可知，对照铁蛋白的起始质量损失温度为254 ℃，铁蛋白-橙皮素共价复合物的起始质量损失温度为263 ℃，铁蛋白-橙皮素共价复合物较铁蛋白的起始质量损失温度增加了9 ℃，由此推断铁蛋白-橙皮素共价复合物的热稳定性具有一定程度的增强[17]。

图7 铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物的热重（A）和紫外吸收热变性曲线（B）Fig.7 TGA profiles (A) and UV denaturation curves (B) of ferritin and hesperetin-ferritin complex

为了验证该结论，比较40～90 ℃范围内铁蛋白和铁蛋白-橙皮素共价复合物的紫外热变性曲线（图7B），研究发现，铁蛋白-橙皮素共价复合物的转变温度为77.8 ℃，显著高于铁蛋白的转变温度（73.2 ℃）（P＜0.05）。推断铁蛋白和橙皮素的共价修饰影响了铁蛋白的空间结构，从而增强了铁蛋白的热稳定性。热加工通常是食品生产的重要步骤，但是加热处理可能会破坏蛋白质的结构和性质，铁蛋白-橙皮素复合物的形成增强了铁蛋白的热稳定性，在一定程度上可以提高铁蛋白在加工过程中的对热耐受性。复合物的热稳定性的增强也有助于其作为包封食品营养小分子的纳米载体在涉及热处理食品中的应用。

3 结 论

本研究通过碱处理方法制备铁蛋白-橙皮素共价复合物。橙皮素与铁蛋白相互作用影响了铁蛋白的结构，并且复合物在不同pH值条件下的溶解度发生了一定程度的改变，其等电点明显降低。另外，橙皮素的结合提高了铁蛋白中铁离子的氧化沉积速率，降低了铁蛋白中铁离子的还原释放速率。同时，橙皮素的共价结合改善了铁蛋白的稳定性。该研究为探索典型食品成分（蛋白质和活性组分）的相互作用提供一定理论指导，也为提高蛋白质的稳定性提供一种新途径。铁蛋白作为一种纳米结构蛋白质，橙皮素的结合为其作为活性成分的传递载体赋予了新的功能特性，这一发现将为铁蛋白在今后食品加工中的应用提供一定的指导和借鉴。