刘佳林,柏玉香,李晓晓,孙纯锐,邱洪伟,干福良,金征宇,*
(1.江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,食品安全与营养协同创新中心,食品安全国际联合实验室,江苏 无锡 214122;2.诸城兴贸玉米开发有限公司,山东 潍坊 262200)
糖原是一种复杂的高度分支的葡萄糖聚合物(结合有少量但具有重要作用的蛋白质),其中的α-D-葡萄糖单元由α-1,4-糖苷键连接组成线性链,并通过α-1,4-糖苷键作为分支点连接形成糖原β-颗粒[1],糖原β-颗粒进一步通过糖原蛋白(glycogenin,GN)二聚体连接形成粒径更大的糖原α-颗粒(粒径最大为300 nm)[2],在透射电子显微镜下呈玫瑰花状[3]。糖原分子中的α-1,6-糖苷键比例约为7%~10%[4],其分子质量范围为105~108Da[5]。
糖原作为动物和微生物体内的主要储能多糖[6],是一种无规则分支的树状大分子[7]。天然糖原在生物体内具有较低的渗透压,例如肝细胞中储存的糖原相当于400 mmol/L的葡萄糖,但对细胞质渗透压仅为该浓度葡萄糖的4×10-7倍[4]。糖原还具有大量随机分布的较短侧链,使其在水溶液中呈球形构象,因此糖原分子具有易溶于冷水并且易与酶接触的特点[8]。除此之外,还可以在温和条件下使用无毒成分将功能基团通过化学反应连接至糖原的葡萄糖残基的羟基部分,或物理地捕获在其超支化的结构内部[9],从而对多糖链进行修饰使其功能化。修饰后的糖原仍然可以部分生物降解[10],因此认为糖原适合应用于食品及生物医学领域[11]。
糖原颗粒尺寸的大小与其生物学功能息息相关,可以在肝脏等器官中形成较大的颗粒从而缓慢释放葡萄糖,也可以在肌肉中形成较小颗粒实现葡萄糖的快速释放[12]。除此之外,其形态大小很大程度上受到提取方法的限制,既需要排除器官中存在的其他蛋白质[13],热水、冷酸和热碱等苛刻条件又可能会导致糖原分子扭曲和降解[14],复杂的制备工艺也限制了糖原作为功能性纳米材料的应用。因此可以根据不同需求,通过体外合成途径获得结构可控的葡聚糖更符合工业生产的要求[15]。由于化学合成无法对糖的区域和立体结构进行控制,因此对碳水化合物构型合成具有绝对控制作用的体外酶促合成方法引起了人们的广泛关注[16]。
目前,研究人员已通过多种酶促串联合成途径制备了葡聚糖树状大分子(glucan dendrimers,GD)、酶促合成糖原(enzymatically synthesized glycogen,ESG)和生物糖原等糖原状α-葡聚糖,其中生物糖原已作为皮肤保湿成分应用于化妆品中,为进一步在食品、医学等领域开发其他多功能糖原状α-葡聚糖产品提供了可能。本文介绍并比较了4 种通过体外酶促串联反应制备糖原状α-葡聚糖的方法,并进一步分析其产物的结构和理化特性,然后讨论了控制糖原状α-葡聚糖精细结构合成的可能性,最后对其应用和发展前景进行了介绍和总结。
糖原在动物体内的合成是由GN表面194 位的酪氨酸与葡萄糖残基共价结合开启,所形成的短糖链作为糖原合酶(glycogen synthase,GS)(EC 2.4.1.1)的底物[17]。体内合成中,尿苷二磷酸(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖作为葡萄糖残基供体,在GS和分支酶(branching enzyme,BE)(EC 2.4.1.18)的联合作用下形成糖原[4],根据糖原的体内合成原理,研究者们继而提出了一系列体外酶促合成方法(图1[18])。
图1 糖原的酶促合成模型[18]Fig.1 Enzymatic synthesis model for glycogen[18]
高分子质量糖原已通过肌肉来源的GS和肝脏或肌肉来源BE以UDP-葡萄糖作为葡萄糖供体体外制备。由于GS和GP(EC 2.4.1.1)具有相同的受体特异性,可形成基本相同的多糖[19],因此有学者提出使用GP取代GS,以可大量获得的高纯度G1P替代UDP-葡萄糖,作为GP催化的葡萄糖残基供体[20]。
最初,合成糖原是1943年由Cori等在体外以G1P作为起始原料,通过分离自肌肉的GP和分离自大鼠肝脏和兔子心脏的BE协同作用形成的[21],并将该方法称为GP-BE法(图1B),又可称为Cori法[18]。之后,其他人使用各种来源的GP和BE重复了此方法[22]。van der Vlist等[23]报道的一种酶促串联反应中,使用马铃薯GP以G1P作为供体底物,在麦芽七糖的非还原性末端催化α-1,4-线性链增长,并使用来源于Deinococcus geothermalis的BE通过改变短寡糖在α-1,6-糖苷键的位置引入分支点,得到了分支度为11%的支链葡聚糖。
然而,使用来源于马铃薯的GP的合成方法获得的糖原状α-葡聚糖具有固定的分支度且会被其他碳水化合物所污染。在此基础上,Ciric等[24]使用来自兔肌肉的GPb代替马铃薯GP,得到了分支度可调(2%~13%)的支链葡聚糖。
在GP-BE法中以G1P为底物,但G1P昂贵的价格限制了其进一步的应用,若添加一种酶可以从廉价原料中获得G1P便可解决上述问题。Waldmann等[25]报道了以蔗糖为原料使用SP(EC 2.4.1.7)和GP合成直链淀粉。SP可以将蔗糖转化为G1P和果糖,这两种磷酸化酶的协同作用可以在恒定的无机磷酸盐浓度下连续进行,不会因磷酸积累而抑制直链淀粉的延长。α-1,4-线性葡聚糖(直链淀粉样聚合物)会在低温下沉淀,但在高温下该现象会被显著抑制[26],因此提高反应温度可以防止沉淀的发生,保持底物浓度。通过对Streptococcus mutans的SP进行随机和定点诱变构建了耐热的SP[27],结合超嗜热细菌Aquifex aeolicus中提取的GP和BE在较高温度下催化转糖基化反应,可合成理化性质和分子形状与天然糖原相似的糖原状α-葡聚糖(图1C),将其命名为GD[28]。并将这种由SP、GP和BE通过酶促串联反应体外合成方法命名为SP-GP-BE法[29]。
与糖原体内合成法中使用的GS功能相同,GP-BE法和SP-GP-BE法中使用了GP催化α-1,4-葡聚糖链的延长,Kajiura等[18]尝试使用短直链淀粉取代延长后的葡聚糖链合成糖原状α-葡聚糖,提出了IAM-BE-AM法。该方法首先使用Pseudomonas amyloderamosa来源的IAM(EC 3.2.1.68)利用淀粉或糊精制备短链直链淀粉,加热使IAM失活后,添加Aquifex aeolicus的BE和重组的Thermus aquaticusAM(EC 2.4.1.25)体外合成糖原(图1D)。将该方法获得的类似天然糖原分子质量的葡聚糖称为ESG[30]。
在该方法中,由于AM能够延长BE难以识别的短链直链淀粉,因此添加该酶可以提高BE的反应效率[29]。与SP-GP-BE法的糖原最高产率30%相比,IAM-BE-AM法制备糖原的最高产率可达到65%[18]。
AS(EC.2.4.1.4)以蔗糖为唯一底物,催化α-1,4-线性葡聚糖的合成并释放出果糖,在生产新型的树突状碳水化合物纳米颗粒方面具有很大的潜力。Grimaud等[31]构建了来自Neisseria polysaccharea的AS和BE反应体系,通过体外模拟糖原生物合成中涉及的延长和分支步骤,以蔗糖为独特底物,合成了糖原状α-葡聚糖(图1E)。它们在溶液中的形态和构象与糖原相似,但与牡蛎糖原和植物糖原相比,合成的α-葡聚糖链长分布较窄,分支度较高,相对分子质量分布较宽。
与天然糖原相似,糖原状α-葡聚糖的结构可分为3 个层次:1)葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接形成的线性链,并通过α-1,6-糖苷键作为分支点连接线性链;2)多条链随机连接形成了具有一个还原性末端的糖原β-颗粒;3)糖原β-颗粒的较长侧链连接形成体积更大的糖原α-颗粒(较少出现),在透射电子显微镜下呈玫瑰花状[32-33]。糖原状α-葡聚糖的结构模型如图2[34]所示。与天然糖原相比,最显著的差别在于天然糖原上还结合了许多参与其分子形成和降解以及负责调节机体功能的蛋白质,例如GN、GS和肌动蛋白等[4]。
图2 糖原状α-葡聚糖结构模型[34]Fig.2 Structural model of glycogen-like α-glucan[34]
2.1.1 表观结构
通过透射电子显微镜观察发现,多数糖原状α-葡聚糖颗粒呈稍微扭曲的圆形,其粒径为20~40 nm(图3C~E)[33],形状与先前报道的天然糖原β-颗粒相似(图3A、B),由于天然糖原分子容易在提取过程中受到损伤,因此目前市场上销售的天然糖原颗粒通常较小(如图3B所示的指甲履螺糖原)。对不同分子质量的糖原状α-葡聚糖进行小角X射线衍射(small angle X-ray scattering,SAXS)分析,发现随着分子质量的增加该α-葡聚糖的形状愈发趋于球形[28]。Ciric等[35]通过GP-BE法,在特定反应条件下(反应时间为72 h,单体与引物的物质的量浓度比为300∶1,平均支化度为12%)合成了类似天然糖原α-颗粒的玫瑰花状α-葡聚糖(图3F),并发现其分子质量高于其他样品[32]。但研究者们分析认为该糖原状α-葡聚糖的α-颗粒与天然糖原α-颗粒的形成方式不同,该颗粒可能是糖原β-颗粒中的较长侧链通过α-1,4-糖苷键连接形成的,此结构还需进一步的研究。
图3 天然糖原及糖原状α-葡聚糖的透射电子显微镜图像Fig.3 Transmission electron microscopic images of naturally occurring glycogen and glycogen-like α-glucan
2.1.2 分子质量
不同来源的天然糖原和通过不同方法制备的糖原状α-葡聚糖结构参数如表1所示。α-葡聚糖的重均分子质量可使用高效排阴色谱法进行检测。天然糖原与糖原状α-葡聚糖的重均分子质量均在105~108Da范围内,天然糖原的重均分子质量主要取决于来源和合成方法,而糖原状α-葡聚糖的重均分子质量则取决于合成条件[28]。
2.1.3 分支度
α-葡聚糖的分支度可通过氢核磁共振确定。糖原状α-葡聚糖的分支度介于8%~12%之间,部分样品高于天然糖原(8%~10%)。由于生物体内的天然糖原在不断地合成与分解,因此很难提高其分支度;而在糖原状α-葡聚糖的体外合成方法中,虽然可以通过改变合成条件提高其分支度,但很难突破其峰值(12.6%),可能是由于分支链的密集分布会限制BE的作用空间[24]。
2.1.4 链长分布
当使用IAM完全水解α-葡聚糖的α-1,6-糖苷键后,可使用高效阴离子交换色谱法检测其链长分布。研究发现与天然糖原相比,糖原状α-葡聚糖的链长分布较窄,最长为14 个葡萄糖残基,具有7 个葡萄糖残基的葡萄糖链数目最多[23]。此外,在SP-GP-BE法和IAM-BE-AM法中发现平均链长具有随分支度的增加而减少的趋势。该特点是BE的底物特异性导致的,Grimaud等[31]认为BE和AS对支链淀粉多糖具有亲和力,优先识别具有一定分支度的α-葡聚糖而不是继续延长和支化线性链。再加上BE无法作用于过短的线性链,从而无法合成具有更短分支链的葡聚糖。
2.1.5 粒径
α-葡聚糖的流体力学半径(hydrodynamic radius,Rh)可通过光散射法测量获得。由表1可知,在同一合成方法下糖原状α-葡聚糖的Rh随着分子质量的增加而增加,从而可根据不同的需求获得Rh为8.5~43.5 nm的产品。对颗粒粒径的控制有利于糖原状α-葡聚糖作为纳米载体进行靶向施药[38]。
表1 天然糖原和糖原状α-葡聚糖的结构参数Table 1 Structural parameters of naturally occurring glycogen and glycogen-like α-glucans
2.2.1 消化特性
天然糖原与糖原状α-葡聚糖通过α-淀粉酶水解后得到的最终产物都包含了葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖和高度分支的糊精分子。不同的是,天然糖原产生的糊精分子重均分子质量仅为10 kDa,而糖原状α-葡聚糖产生了更大的糊精分子(重均分子质量为1 000~1 600 kDa)[39]。出现此差别的原因是糖原状α-葡聚糖分子中相邻的两个α-1,6-糖苷键之间仅有0~2 个α-1,4-糖苷键,从而防止α-淀粉酶作用于葡聚糖分子的核心区域[32,41]。
为了测试口服糖原和糖原状α-葡聚糖通过胃肠系统时的降解程度,研究人员使用抗性淀粉检测试剂盒(胰α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的混合物)评估淀粉类食品的膳食纤维含量。在酶法合成糖原样品中检测到相当数量的膳食纤维(16.9%~22.1%),而天然糖原却极少(低于0.2%)[39]。
2.2.2 溶解特性
与天然糖原相同,糖原状α-葡聚糖易溶于水,水溶液呈乳白色,加入碘液后显示红棕色[32,42]。此外,由于糖原状α-葡聚糖分子呈球形并具有致密的分支结构[32],与其他溶液黏度较高的分子比,其链长较短,减少了与其他聚合物间的缠结,因此其固有黏度非常低,并且没有分子质量依赖性。质量分数小于20%的水溶液显示出低黏度(低于70 mPa·s),质量分数高于20%时,溶液黏度急剧增加[33]。
天然糖原复杂的体内合成途径发生在糖原代谢的细胞区域中,该区域中的膜以及代谢调控作用都会限制其分子质量的大小[31],此外,提取糖原的结构取决于来源和提取方法,再加上提取过程中无法排除痕量的其他物质,获得的每个糖原样本具有较大差别[32]。因此想要获得结构明确并可控的糖原,需要通过体外酶促合成途径。
Kajiura等[18]在IAM-BE-AM法中使用IAM处理DE-9糊精形成不同葡萄糖当量的糊精底物。在相同底物浓度下,DE-3糊精(重均分子质量为3.54×105Da)和DE-9糊精(重均分子质量为4.57×104Da)作为底物时,DE-3糊精产生了较多的平均分子质量较低的ESG。而使用不同浓度底物时,发现在较高的底物浓度下产物的平均分子质量较低。此外,不同来源的淀粉因其具有不同的链长和直链淀粉含量,通过IAM-BE-AM法合成的ESG平均分子质量也有所不同。该方法虽然可获得不同分子质量的产物,但以淀粉为原料无法控制脱支处理后产物的分子质量,故无法控制产物精细结构的合成。
有报道指出,串联SP-GP合成直链淀粉时,通过更改初始蔗糖与引物的浓度比例可以精确控制合成的直链淀粉的分子质量[26]。因此,添加BE的SP-GP-BE法中,通过控制小分子质量的GD(重均分子质量为1.22×105Da)和G1P的比例可以制备分子质量可控的糖原状α-葡聚糖[28]。此外,该方法合成的葡聚糖分散系数较低,是一种均匀聚合物,有利于其进一步应用。
在几种合成方案中,由于AS可以在没有葡聚糖的情况下以蔗糖为底物产生直链淀粉,因此难以仅通过改变葡聚糖的量对其产物分子质量进行控制[43],但可以对天然糖原(例如牡蛎糖原)进行修饰。在存在蔗糖作为糖基供体的情况下,使用来自Neisseria polysaccharea的重组AS体外糖基化商用牡蛎糖原,可形成具有特殊核-壳结构的糖原状α-葡聚糖,其形态和结构取决于初始蔗糖与糖原的比例、含量和酶的处理时间[44]。通过AS-BE法制备超支化α-葡聚糖时,Grimaud等[31]认为调整初始蔗糖浓度和两种酶的比例可以改变产物的结构,提高BE的比例可以提高分支分子的数量,并使平均粒径降低,粒径分布变窄。
分子粒径的大小不仅取决于分子质量,还取决于分支程度,除上述调控方法外,GP-BE法中当使用兔肌肉中的GP时发现分支度可随反应时间增加而增加,而在相同的反应条件以及不同的G1P和麦芽七糖比例下,分支度将随聚合度的增加而降低[24]。
Kajiura等[30]于2009年4月对日本有关公众对糖原的最新印象进行了问卷调查。调查结果显示,绝大多数人(85.6%)知道“糖原”一词,并且将“糖原”一词与健康联系在一起。然而天然糖原从天然物质中提取,来源和提取方式不同将影响天然糖原的结构和功能。故ESG状α-葡聚糖被认为是天然糖原的有效替代品,其对人体的健康益处值得进一步研究[45]。
急性毒性研究表明,口服ESG在实验大鼠中表现出非常低的急性毒性,在体外细菌回复突变实验中也未显示任何诱变特性。并且以20 g/kgmb的剂量进行的为期13 周的亚慢性毒性研究中也未发现具有毒理学问题,支持其用于食品成分的开发[41]。
近年来,格力高公司推出了由IAM-BE-AM法生产的糖原状α-葡聚糖作为化妆品成分,将其命名为“生物糖原”。先前的研究发现,皮肤中糖原的含量会随着年龄的增长而减少。生物糖原可通过增加皮肤中的透明质酸和神经酰胺的含量,从而提高化妆品的保湿效果。此外,生物糖原还可抑制中波红斑效应紫外线(ultraviolet radiation B,UVB)诱导的活性氧的积累增加与抗氧化相关的蛋白表达。
由于糖原状α-葡聚糖的高溶解性和低渗透压特性,可将其溶液用作运动过程中水分和碳水化合物补充剂。在耐力运动员所需的运动饮料中,使用了两种类型的碳水化合物:一种碳水化合物(例如单糖或二糖)可被迅速吸收;而另一种(如麦芽糖糊精)会在胃肠道中被缓慢吸收。Inagaki等[46]研究认为ESG与麦芽糊精一样吸收速度缓慢,但可维持更长时间的血浆葡萄糖水平,因此可以作为运动饮料中的能量补充剂。
在体外消化实验中发现,糖原状α-葡聚糖经消化后生成高支化大糊精,因此分析其可能具有膳食纤维的作用。分析化学家协会方法2002-02对ESG的评估显示,ESG含有约20%的膳食纤维,并且通过在大鼠中的单次口服给药实验确定,ESG的血糖指数约为79[47]。ESG未消化的部分可称为抗性糖原,可通过刺激肠道细胞激活免疫细胞[48]、降低抗氧化应激和促炎性细胞因子作为预防炎症性肠病的新材料[49],当其到达盲肠后可被微生物群转化为短链脂肪酸[47]。多项研究表明,膳食纤维有益于脂质代谢[50]。ESG可降低附睾脂肪组织和血浆中的甘油三酯水平,并增加了正常饮食大鼠的高密度脂蛋白/总胆固醇比率[47],还可显著减轻腹部脂肪组织的质量[51]。因此,饮食中补充ESG可能有助于减少由高脂饮食引起的脂肪组织和肝脏中脂质堆积,并降低血浆胆固醇水平[52-53]。
除可作为膳食纤维外,ESG还可通过刺激宿主免疫反应(例如巨噬细胞)显示抗肿瘤活性。以50 μg/mL的剂量口服GD可延长荷瘤小鼠的存活时间并防止代谢紊乱[54]。Kakutani等[29]报道了相对分子质量约为5.0×106~6.5×106但不超过1.0×107的ESG具有刺激巨噬细胞的活性,并通过实验证明其活性取决于其分子质量,而不是取决于其精细结构[55]。因此体外合成糖原状α-葡聚糖与天然糖原相比,更易对其分子质量进行控制,有利于其大规模生产。
由于天然糖原是从核心蛋白生长形成的,本身就是一种超支化的糖缀合物。因此,若将酶促反应中所需的麦芽寡糖引物衍生化,则可体外合成定义明确的合成超支链糖缀合物,有利于进一步了解天然糖原的生物合成及其聚集行为。例如van der Vlist等[9]将麦芽七糖分别与丁二胺、三(2-氨基乙基)胺和胺官能化的甲基醚-聚乙二醇偶联,形成的3 种麦芽七糖衍生物可以作为引物参与马铃薯磷酸化酶与BE催化合成超支化葡聚糖二嵌段共聚物。但值得注意的是,聚乙二醇的存在会降低酶活性和产物分支度。
此外,还可以通过向糖原的非还原端添加官能团来丰富其功能。由于GP具有宽松的糖基供体底物识别特异性[56],已报道多种使用G1P的类似物底物作为糖基供体,从而通过GP催化的糖基化反应在非还原端合成的具有不同糖残基的非天然寡糖。如图4所示,热稳定的GP可识别α-D-氨基葡萄糖1-磷酸(α-D-glucosamine 1-phosphate,GlcN-1-P)和α-D-葡萄糖醛酸1-磷酸(α-D-glucuronic acid-1-phosphate,GlcA-1-P),催化GD的连续葡萄糖醛酰化和葡糖酰胺化作用,以产生在非还原端具有调节位置的氨基和羧基的树突状两性α-葡聚糖。由于其与蛋白质相似的两性性质,有望替代蛋白质应用于药物载体和支架等生物医学材料[57]。
图4 GD连续葡糖醛酰化和葡糖酰胺化合成树突状两性α-葡聚糖示意图[57]Fig.4 Synthesis of dendritic amphoteric α-glucans by successive glucuronylation and glucosaminylation of GD[57]
除上述方法外,还可利用糖原状α-葡聚糖外围的大量功能性端基进行聚合反应或与周围环境相互作用,使目标物与葡萄糖残基的羟基部分物理连接或被捕获在超支化结构内部,将其作为一种递送载体。胆固醇修饰的ESG通过在水中自组装形成粒径约35 nm的簇状纳米凝交,该两亲性多糖纳米球能够与多种蛋白质稳定地络合,并具有很高的疏水性。另外,可通过与环糊精(cyclodextrin,CD)复合而形成超分子纳米复合物,用于提高酶热稳定性的人工分子伴侣(图5)[58]。Takahashi等[59]在此基础上将N,N-二乙基乙二胺作为阳离子基团引入胆固醇修饰的ESG,合成了阳离子两亲性ESG衍生物。其通过疏水和静电相互作用与蛋白质形成强而稳定的复合物,可以稳定地抵抗蛋白质热变性,因此能够有效地进行蛋白质的细胞转运。也可通GD的羟基与十二烷基异氰酸酯的反应合成两性GD。两亲性GD可有效结合蛋白,已成功地将β-半乳糖苷酶传递到细胞中,同时保持了酶的活性,因此该分子可也作为蛋白质递送载体[40]。
图5 CHESG-CD复合物的形成及其蛋白质递送活性示意图[58]Fig.5 Schematic representation of the formation of cholesterol groupbearing enzymatically synthesized glycogen-β-cyclodextrin-cyclodextrin complex with protein delivery activity[58]
为扩大现有的葡萄糖聚合物的应用范围,研究人员参考糖原的体内合成方法提出了体外合成糖原状α-葡聚糖的可能,并随着研究的深入,不断拓展合成思路,从GP-BE法中衍生出了SP-GP-BE法、IAM-BE-AM法及AS-BE法。在过去的研究中,研究者们发现所合成的糖原状α-葡聚糖具有与天然糖原相似的溶液性质和分子形状,与此同时,他们也意识到其链长分布、α-1,6-糖苷键的分布以及消化特性与天然糖原具有一定的差异。因此,对于合成的糖原状α-葡聚糖与天然糖原精细结构的分析比较(例如对吸附水分子的氢键网络及颗粒内、外部链密度比较等)需要更深入的研究和理解。此外,对合成的糖原状α-葡聚糖的精细结构(如分子质量、分子粒径)控制、生产原料及引物成本降低和产量提高的进一步研究,是充分发挥其在食品、医疗及化妆品等领域商业价值的重要基础,也是今后的主要发展方向。