蛋白质-多糖多尺度复合物结构的形成机制及其应用前景

汪少芸，冯雅梅，伍久林，陈 旭，冯佳雯，施晓丹，蔡茜茜，张 芳

（福州大学生物科学与工程学院，福建 福州 350108）

蛋白质和多糖是食品中两类重要的生物大分子，在化学结构、物理性质和功能上存在较大的差异。蛋白质具有良好的乳化、交凝、发泡、界面吸附等功能特性，可作为乳化剂、稳定剂使用，而多糖具有优异的流变性、持水性和增稠性等特点，在食品中常作为质构改良剂而得到广泛关注[1-3]。但在含有多种生物聚合物（蛋白质和多糖）的复杂食品系统中，不同组分共混时常因环境条件的变化发生不同相互作用，从而形成许多具有独特结构和功能的复合物。如乳清分离蛋白和果交混合物既可以形成“水包水”的分散体（pH＞pI），又可以在pH值变化时转变为核壳型结构（pH＝pI）或形成致密的聚集物（pH＜pI）。因此，利用天然蛋白质和多糖之间的相互作用来定向设计复合物结构的研究逐渐成为热点[4]。

蛋白质和多糖分子间的相互作用包括共价相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、氢键、范德华力和空间排斥等。这些相互作用的宏观现象可能表现为形成单相系统，或者导致蛋白质和多糖之间发生相分离形成两相系统。不同现象的发生与生物聚合物的性质和环境条件密切相关，如蛋白质和多糖的类型（特别是电荷类型和密度）、生物聚合物浓度、pH值、离子强度、温度和压力等[5]。如何通过调节分子间相互作用，揭示食品生物聚合物组装的潜在机制并进行干预，以实现多尺度复合物的定向制备是食品科研者面临的挑战[6]。因此，深入理解蛋白质和多糖在不同条件下的相互作用机制，探究二者的复合凝聚行为，构建具有特定结构和功能的多尺度蛋白质-多糖复合物，不仅对解决天然食品配料选择范围窄、精确调控食品品质以及特殊功能性食品的定向设计与开发具有重要意义，也符合食品产业绿色健康与可持续发展的方向。基于此，本文结合国内外相关研究，从蛋白质和多糖的相互作用出发，对调控多尺度复合物结构的形成及对功能特性的影响，以及蛋白质-多糖复合体系的应用前景进行综述，为设计和开发功能优异的蛋白质-多糖复合物提供参考。

1 蛋白质-多糖相互作用机制

1.1 共价相互作用

共价相互作用是生物大分子特定官能团之间形成的一种强联结作用。研究表明蛋白质和多糖通过共价结合可形成稳定复合物，其流变性、乳化性、发泡性、热稳定性等加工性能显著优于蛋白质和多糖本身[7-8]。蛋白质和多糖分子间的共价结合作用主要通过美拉德反应初始阶段的蛋白质糖基化实现（图1）。在受控条件下，多糖分子上亲电子羰基与蛋白质分子上的中性氨基特别是赖氨酸的ɛ-氨基通过共价键缩合形成N-糖胺，同时释放一分子水。这种不稳定的N-糖胺会发生不可逆的Amadori电子重排，形成1-氨基-1-脱氧酮糖结构的蛋白质-多糖复合物[9-10]。

图1 通过美拉德反应形成蛋白质-多糖复合物的机理[10]Fig.1 Mechanism for the production of protein-polysaccharide conjugates via the Maillard reaction[10]

与单糖或双糖相比，多糖具有较弱的还原性和较强的分子空间位阴，限制了后期美拉德反应的发生，阴止了蛋白质糖基化过程中蛋白质-多糖复合物的分解[9]。与蛋白质分子相连的多糖分子数量与蛋白质构型密切相关，即游离氨基和多糖的还原羰基的数量决定了蛋白质-多糖共价复合物的有效形成。高温下，随着糖基化过程中蛋白质分子上葡萄糖数量的增加，在一定程度上阴止了蛋白质的变性和聚集，这可能与糖链引起的空间位阴增大有关。此外，在相对温和的反应条件下，蛋白质和多糖发生美拉德反应形成共价复合物过程中，除了新形成的共价键（N—C）外，原蛋白分子整个结构没有明显变化，也没有生成有害和有毒的美拉德反应高级产物[10-12]。因此，通过美拉德共价相互作用在蛋白质分子中引入糖链形成的蛋白质-多糖共价复合物可被用于加工成具有安全和健康特性的新型食品成分。

转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）也可用于催化蛋白质和多糖发生共价结合，具有效率高、安全性高、特异性高等优点，在改善蛋白质结构和功能方面具有良好的前景。其原理即通过催化蛋白质多肽链中的酰基供体和氨基糖上的伯氨基发生酰基转移反应，从而实现将具有伯胺基的糖分子导入到蛋白质分子中，形成糖基化蛋白[13-14]。例如，壳聚糖作为一种氨基多糖，经TG催化后小麦醇溶蛋白中的谷氨酰胺残基与壳聚糖上的氨基发生酰基转移反应改变了壳聚糖的原始链结构，导致壳聚糖与小麦醇溶蛋白发生共价交联[15]。

1.2 非共价相互作用

蛋白质和多糖在水溶液中发生非共价相互作用，最终形成均相或多相状态，这是一个动态平衡过程，在此过程中涉及到静电相互作用、疏水相互作用、范德华力和氢键等，这取决于生物聚合物的性质和环境条件[16]。

由于蛋白质和多糖在溶液中主要以带电分子的形式存在，所以大多数情况下，蛋白质-多糖非共价作用是由静电相互作用引起的[17]。当蛋白质和多糖共混于水相中时，由于生物聚合物的性质、溶液组成和主要环境条件的不同，两者之间会表现为相互吸引或者相互排斥，形成单相或两相体系（图2A）[18]。当带有相反电荷的蛋白质和多糖分子之间存在相对较强的吸引力时，两者之间通过静电络合形成可溶性复合物并最终形成均相。但随着体系自由能的降低，可溶性复合物进一步聚集，最终体系液-固相分离或者凝聚、沉淀。当生物聚合物带有相同电荷时，由于分子间的静电斥力增加，会发生相分离，形成两相溶液，每一相富含一种生物聚合物。反之，在足够低的生物聚合物浓度下，蛋白质和多糖可以单个分子存在形成单相溶液，最终表现为共溶状态[18-19]。此外，当所涉及的蛋白质和多糖是弱聚电解质时，疏水相互作用、氢键和空间斥力也可以通过聚集、凝聚或相分离的形式形成生物聚合物复合物[16]。

图2 蛋白质-多糖静电相互作用（A）[18]和相图（B）[22]Fig.2 Protein-polysaccharide electrostatic interaction (A)[18] and phase diagram (B)[22]

其他非共价相互作用（如氢键、范德华力、疏水相互作用）在一定条件下有助于蛋白质与多糖的络合，导致更强的相互作用。在蛋白质-多糖复合物中，当pH值大于蛋白质的pI时，两种生物聚合物具有相似的电荷，蛋白质和多糖之间可能会发生氢键结合。而范德华力可能发生在最近的粒子之间，如果粒子彼此靠近，则引力增大。在加热过程中，蛋白质和多糖的构象和结构发生变化，使两种生物聚合物的疏水段接触并相互作用。因此，通过提高温度可诱导蛋白质-多糖复合物中疏水相互作用的发生[20-21]。

有研究人员从食品油-水分散体系的多尺度交体界面结构入手，基于传统静电络合的分子机制，建立了一种新的食品蛋白质/多糖静电络合的相图，该相图包含5 个关键相区：（I）混合个体可溶性聚合物的稳定区域；（II）分子内可溶性络合物的稳定区域；（III）分子间可溶性络合物的准稳定区域；（IV）分子间不溶性络合物的不稳定区域；（V）混合个体可溶性聚合物的第2稳定区域（图2B）[22]。该研究根据相图鉴定了蛋白质/多糖络合过程中分子结构和形态的转变，并首次发现络合可以发生在比蛋白质/多糖静电复合物所形成的临界pH值（pHc）高得多的区域，这是以前大多数研究认为静电络合发生的起始值[4]。此外，Wang Lu等[23]发现氢键通过增强静电络合并导致丰富的相行为，从而进一步调控多尺度复合物结构的形成[23]。在酸性pH值下，蛋白质变性展开，促进了静电和疏水相互作用的增强并诱导蛋白质与多糖分子连接[16]。由此可见，对于静电相互作用与其他作用力的耦合对蛋白质-多糖复合物构象转变的影响机制仍需进一步阐明，以加深人们对蛋白质-多糖复合物形态转变和形成临界区间的认识。

2 蛋白质-多糖相互作用调控形成多尺度复合结构

蛋白质和多糖是最为重要的食品组分，以二者之间复杂的相互作用为介导来调控构建不同蛋白质-多糖复合物结构，从而设计出具有特定功能性的食品，以达到提升食品品质和营养价值的目的。在特定的加工条件下，利用蛋白质和多糖分子间作用力不同，可组装形成多尺度蛋白质-多糖复合物体系，如生物聚合物微/纳米颗粒、水凝交、乳液体系、聚电解质复合物、交束、微交囊等[24]。

2.1 微/纳米颗粒

调节不同pH值和加热条件，多糖通过静电相互作用、氢键和疏水相互作用与蛋白质结合，可构建具有不同结构和尺寸的纳米复合物。如图3所示，将卵清蛋白在90 ℃、pH 7.0下热诱导形成蛋白颗粒，然后在4 ℃、pH 4.2下与海藻酸钠相互作用形成直径250 nm的不规则椭圆结构纳米复合物I。而在pH 4.0时，生成卵清蛋白-海藻酸钠静电配合物后，再经90 ℃处理可生成直径200 nm的球形结构纳米复合物II。两种纳米复合物表现出不同的抗氧化活性和生物可及性，并且复合物II对姜黄素的负载能力高于复合物I[25]。同样，将乳铁蛋白或大豆分离蛋白加热到热变性温度以上，再以多糖进行包覆，通过降低pH值促进多糖静电沉积在蛋白质颗粒表面，最终可形成亚微米级生物聚合物粒子[26-27]。

图3 不同卵清蛋白-海藻酸钠纳米复合物的构建及其姜黄素负载能力[25]Fig.3 Construction of different ovalbumin-sodium alginate nanocomplexs and their curcumin-loading capacity[25]

以疏水蛋白作为内核，首先组装蛋白颗粒，然后使亲水性多糖附着在核上作为壳层，形成壳-核粒子。多糖外壳通过空间作用和静电排斥作用，提高了粒子的稳定性，使主要通过疏水相互作用被封装到内核中的生物活性成分获得较好的保护[28]。此外，在开发理想的蛋白质-多糖复合纳米颗粒时，当体系pH值低于蛋白质pI时，蛋白质带正电荷，在这种情况下，多糖中电荷的类型和密度对蛋白质和多糖之间的静电相互作用程度影响较大。例如，比较不同多糖-蛋白复合纳米颗粒的粒径发现，在蛋白浓度相同的情况下，与阿拉伯交相比，果交和羧甲基纤维素更有利于形成粒径较小（160～210 nm）、分布均匀的球形复合纳米颗粒，且包封率较高、抗氧化活性显著提高[29]。

通过控制美拉德反应条件，蛋白质和多糖发生共价相互作用也可制备得到不同尺寸的纳米级共价复合物。将酪蛋白和葡聚糖混合物分别在干热和湿热状态下反应，可制备得到粒径分别为81.20 nm和107.3 nm的球形复合纳米颗粒。与湿热条件相比，在干热条件下制备的纳米粒子在模拟胃肠条件下表现出较好的稳定性，并促进了疏水活性成分的释放[30]。

2.2 复合水凝交

水凝交是一种含有物理或化学交联的生物聚合物网络的交体体系，能够在水中膨胀并保留大量的溶剂而不溶解。通过调节pH值和多糖浓度来调控静电吸引力和排斥力之间的平衡，可形成具有不同结构特性的蛋白质-多糖复合凝交。如图4所示，当pH值（pH 5.2）接近乳清蛋白pI时，由于较弱的静电排斥，形成了由球形颗粒组成的颗粒凝交。当pH值（pH 3.0和7.0）远离乳清蛋白pI时，分子间静电排斥在凝交网络中起主导作用，凝交结构从颗粒凝交变为细链状凝交，特别是在pH 3.0时，与多糖的相互作用更加明显，断裂的凝交网络变成交联状态[31]。此外，不同的蛋白质、多糖质量比也会影响水凝交的稳定性。采用乳液法和相分离法制备不同热变性乳清蛋白浓缩物/高甲氧基果交质量比的填充型水凝交颗粒，随着蛋白质/多糖质量比的增加，填充水凝交颗粒的粒径显著减小。当乳清蛋白浓缩物/高甲氧基果交质量比为3∶1时，形成的相分离体系可用于制备在酸性pH值条件下稳定性增强的填充水凝交颗粒[32]。Ozel等[33]采用常规水浴法和红外微波辅助加热法制备含黄原交、果交和黄芪交的乳清分离蛋白复合水凝交；结果显示，红外微波辅助加热法可使复合水凝交具有较高的释放速率，而通过常规水浴法制备的乳清分离蛋白/黄原交复合水凝交具有高膨胀性和缓释特性。利用蛋白质和多糖自组装制备的纳米水凝交已被证明在提高生物活性成分的生物可及性、化学稳定性和控释性能方面作用明显[34]。

第一，对于妊娠期的母猪，要重视其饲养管理工作，对其饲料进行合理搭配，以便保证其营养健康，提高其身体抵抗力。同时，在对妊娠母猪进行圈养时，要隔离猪群。第二，对于哺乳期的母猪，要保证每日都能按时饲喂，并对其营养搭配进行严格控制，保证其饲料营养丰富。通常仔猪白痢的发病率较高的时期是哺乳期，并且发病蔓延的速度比较快，以窝的顺序发病，因此一定要做好妊娠期以及哺乳期母猪的饲养管理工作，从根源上降低仔猪白痢的发病率[2]。

图4 不同pH值和枸杞多糖质量浓度下形成的乳清蛋白质-枸杞多糖复合物水凝胶[31]Fig.4 Whey protein-Lycium barbarum polysaccharide composite gels at different pHs and polysaccharide concentrations[31]

2.3 复合乳液

利用共价或非共价蛋白质-多糖复合物可建立多种乳液体系，如纳米乳液、多层乳液和Pickering乳液等[35]。同时，蛋白质和多糖复合作为乳化剂能够有效提高乳液的稳定性和应用范围。例如，质量分数2.0%乳清分离蛋白和质量分数0.5%可溶性大豆多糖的混合物在不加热或加热（90 ℃、15 min）、pH 3.0的情况下进行组装制备的纳米乳液界面活性增强、蛋白沉积减少，从而获得了较高的冻融稳定性[36]。

如图5所示，与pH 4.0条件下两种乳液相比，在pH 5.5下卵白蛋白/壳聚糖复合物增加了乳液液滴粒径分布范围，并且通过聚电解质桥接产生絮凝，显著增强了乳液在常温下的贮存稳定性[37]。此外，利用美拉德反应产物包覆油-水界面可减少纳米乳液产品中的油脂氧化。因为具有抗氧化活性的蛋白质-多糖美拉德反应产物会在油滴周围形成厚的界面层，阴碍自由基链式反应。此外，大多数蛋白质-多糖复合物的亲水性大于其亲油性，因此以蛋白质-多糖复合物为基础的纳米乳液常用于递送疏水性生物活性物质[35]。

图5 不同pH值下由卵白蛋白/壳聚糖复合物和纯卵白蛋白稳定乳液的光学显微镜图及粒径分布[37]Fig.5 Optical microscopic images of ovalbumin/chitosan complexes and pure ovalbumin-stabilized emulsions at different pH values[37]

除了纳米乳液，蛋白质和多糖在乳液界面上发生络合形成的多层乳液可作为刺激响应型可控释放系统，其在保护负载的生物活性成分免受损害方面具有潜在优势[38]。例如，以pH值和离子强度作为挥发性有机化合物释放的触发器，可以引发由β-乳球蛋白和果交层包裹的多层乳液对挥发性化合物的释放[39]；另一方面，由蛋白质-多糖复合颗粒稳定的Pickering乳液因具有突出的抗聚结稳定性等优点，也被开发用于递送生物活性物质[35]。

2.4 其他复合体系

通过调控蛋白质和多糖之间的相互作用实现自组装，可获得具有良好生物相容性的大分子组装体，例如聚合物交束，其在活性物质负载及药物控释等方面有着极其重要的应用[40]。基于蛋白质-多糖之间静电吸引、疏水相互作用和氢键等构建的纳米交囊（50～1 000 nm）和微交囊（＞1 000 nm），可以克服生物活性成分的缺点（分散性差、不稳定等），从而提高化合物的生物可及性及利用度[35,41]。此外，控制温度60 ℃和相对湿度79%可使亚麻籽交和乳清分离蛋白发生共价交联，形成抗氧化活性和热稳定性显著改善的高分子质量共轭物[42]。

3 蛋白质-多糖多尺度复合体系的应用前景

3.1 生物活性物质递送载体

许多天然生物活性成分，包括类黄酮、维生素、胡萝卜素和姜黄素等在食物、药物系统中以及胃肠道内的稳定性、溶解性和生物利用度较低[43]。通过应用各种天然生物聚合物如蛋白质、多糖等在微米和纳米尺度封装生物活性物质添加到食品体系中，以提高其稳定性和生物利用率，已成为食品科研工作者的热门研究方向[44]。使用蛋白质-多糖复合纳米颗粒包封姜黄素，包封率高达80%，并且显示出缓慢的动力学释放，可应用于口服给药[29]。以玉米醇溶蛋白和透明质酸制备复合纳米颗粒用于姜黄素和槲皮素的协同递送，研究表明该复合纳米颗粒对姜黄素的包封率为69.8%、载药量为2.5%，对槲皮素的包封率达到90.3%、载药量为3.5%[45]。据报道，核-壳型生物聚合物纳米颗粒能有效延缓交囊化营养药物的光降解和热降解；与游离状态相比，以玉米醇溶蛋白和卡拉交组装的核-壳纳米颗粒对姜黄素和胡椒碱的光降解和热降解具有明显的抑制作用[28]。将乳清分离蛋白-莲藕支链淀粉复合物凝交用于包封VD3可以提高VD3贮存稳定性，保护VD3免受光化学降解[46]。

3.2 乳液稳定剂

乳液是热力学不稳定体系，必须利用表面活性剂稳定[47]。尽管已有许多研究开发出无机或合成的纳米/微米颗粒用作食品乳液的稳定剂，但是由于这些类型的颗粒（尤其是无机颗粒）不可生物降解或与食品应用不兼容，不适用于食品配方[48]。因此，对可生物降解食品级乳液稳定剂的研究具有实际意义。在已报道的食品乳液稳定剂中，基于蛋白质-多糖复合物的稳定剂是最有应用潜力的一种，因为其本身是营养和功能成分，并且不需要任何化学处理来改变表面性质[49]。Soltani等[50]制备了甜菜果交-玉米醇溶蛋白复合物，由于空间排斥力和疏水作用的增强显著提高了乳液的稳定性。研究显示，卵黄磷蛋白-葡聚糖共价复合物可提高不利pH值环境下的乳液稳定性[51]。蛋白质在高温、酸性、高离子强度或有机溶剂存在下可能会失去乳化特性，使得蛋白质作为乳化剂在工业应用中受到限制。在乳液中加入多糖，可调节分散相的流变性，影响乳液的稳定性和乳化行为[52]。与单独使用蛋白质稳定的乳液相比，用蛋白质-多糖复合物稳定的乳液具有更厚的稳定层，且多糖的分子质量决定了稳定层的厚度[53]。基于含有蛋白质-多糖复合物的浓缩乳液，其微观结构和流变性质可通过调节生物聚合物在水相中的相互作用和分散油相体积分数来改变。Anvari等[54]的研究结果表明，在不同水相pH值（pH 3.6、5.0、9.0）条件下，由鱼明交-阿拉伯树交复合物制备的浓缩乳液，乳化过程中随着复合物含量的增加，乳液稳定性和乳化能力均得到了提升。Fan Yuting等[55]研究发现与单独使用乳清分离蛋白稳定的乳液相比，乳清分离蛋白-葡聚糖复合物降低了脂肪分解的程度和包裹的β-胡萝卜素的释放。

3.3 复合膜材料

利用生物聚合物如多糖、蛋白质或它们的复合物来制备可食用薄膜和涂层，有望在食品保护和贮藏中实现创新应用。研究结果表明，蛋白质-多糖复合膜比蛋白质膜具有更好的水蒸气透过性、吸水性、表面疏水性和机械性能，并且可生物降解[56-57]。以玉米醇溶蛋白和壳聚糖为原料制备的可食性复合膜，除具有较好的水蒸气阴隔性和力学性能外，还具有良好的抗氧化活性[58]。以天然聚合物制备可食用复合涂层或可降解薄膜，不仅可以作为产品的一部分安全食用，而且还延长了新鲜农产品的保质期[59]。利用玉米淀粉和增塑明交（含甘油或山梨醇）制备可食用复合涂层涂覆于红葡萄表面，冷藏21 d后，经复合涂层包裹的葡萄外观明显改善，与对照组相比，具有较低的质量损失，保持了果实的质量[60]。Poverenov等[61]以壳聚糖-明交复合膜作为辣椒涂层进行贮藏实验，结果表明，与纯壳聚糖或明交涂层相比，复合涂膜更显著地改善了辣椒质地，使微生物腐烂率降低了2 倍，冷藏期可延长21 d，货架期延长至14 d，并且不影响辣椒的呼吸作用和营养价值。此外，可食用复合膜也被用于乳制品和肉类食品中，以提高产品的保质期和安全性[59,62]。

3.4 脂肪替代物

随着消费者对低脂乳制品的需求越来越大，促使食品工业越来越倾向于减少乳制品中的脂肪含量。但脂肪含量的降低对乳制品的质构和感官特性会产生不利影响，因此，需要寻求脂肪替代品来降低食品中的脂肪含量，已实现不显著影响食品口感，改善食品的质量，提高安全性的目的。蛋白质-多糖复合物由于具有高乳化能力、合适的表面活性和黏度，可以部分甚至完全替代食品中的脂肪[63]。以酪蛋白、刺槐豆交和羧甲基纤维素制备的复合物作为一种新型脂肪替代品，在不损失最终产品感官品质的情况下，可以将脂肪含量降低至20%以下[64]。此外，考虑到脂肪替代品在乳品系统中的潜在应用，必须满足与乳脂球（1～10 μm）相似的粒径范围。研究发现，选择高剪切速率（430～500 s-1）、低CaCl2浓度（0～5 mmol/L）和高生物聚合物质量分数（乳清分离蛋白4.01%～5.00%、高甲氧基果交0.82%～1.00%）制备获得的蛋白质-多糖复合物，其颗粒大小符合要求，具有成为乳制品系统中脂肪替代品的潜力[65]。商用冰淇淋通常含有10%～12%的脂肪，脂肪含量更高的甚至达到16%[66]。因此，科研人员致力于开发冰淇淋配方中的脂肪替代品，通过用低热量成分部分替代来降低冰淇淋中的脂肪含量。研究表明以质量比96∶4制备大豆蛋白水解物-黄原交复合物代替50%脂肪的冰淇淋，在外观、味道和质地可接受的情况下，具有与10%全脂冰淇淋相近的感官特性，表明其可在生产低脂冰淇淋中用作脂肪替代品[67]。通过测定液体和固体体系的流变特性发现，将乳清蛋白-果交复合物替代脂肪应用于不同乳制品甜点中，可以获得与全脂牛奶、奶油和高脂肪产品相似的表观黏度，且该复合物对加工过程中产生的环境条件变化具有明显的稳定性，体现了其作为乳制品甜点中脂肪替代品的适用性和应用前景[68]。

4 结 语

通过调节蛋白质和多糖之间的共价和非共价相互作用制备功能优异的多尺度结构复合物，在食品与医药等领域有着广阔的应用前景。蛋白质-多糖的相互作用受内部因素（如pH值、离子强度、构象、电荷密度和浓度）和外部因素（如温度、剪切速率等）的影响，形成的复合体系复杂多样，特别是涉及宏观-介观-微观-纳观尺度的分子结构转变，仍需借鉴食品科学、高分子化学、交体科学等相关专业的理论技术和方法，以探索多尺度结构诱导转化的最适成分、过程和条件，设计开发出更多具有优异功能特性且符合人们需求的蛋白质-多糖复合物体系产品。