MPO基因多态性与川崎病易感性及冠状动脉损害的 相关性研究

王福玲，陈丽清，肖蓉，马慧芳

(内蒙古自治区妇幼保健院，内蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

川崎病(Kawasaki disease，KD)又称皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种目前病因不明的以急性发热、多形性皮疹，颈部淋巴结肿大等为临床表现的全身性血管炎综合征，亚洲地区多见，好发于5岁以下幼儿[1]。首次由日本学者川崎富作报道，以发热、球结膜充血、口腔黏膜改变、手足硬肿、皮疹、颈部淋巴结肿大为典型临床症状，此外病变易累及全身中小血管，其中较为严重的是累及冠脉血管，不仅可引发血管炎、冠状动脉损害(Coronary artery lesions，CAL)，部分严重病例可形成巨大冠状动脉瘤，甚至较少部分患儿存在冠状动脉狭窄与血栓形成、猝死等，且儿童时期发生的CAL可增加成年早期发生心肌缺血、冠状动脉粥样硬化的危险[2]，因此KD所致CAL是目前临床治疗非常棘手的严重问题，寻找其病因，改善患儿预后更是刻不容缓。

近年来，根据大量KD的流行病学调查数据发现，KD的发生与其遗传性及地区特异性有着重要联系。且经过全基因组关联分析(GWAS)与全基因组连锁的分析研究[3]，已发现多个基因的SNP位点参与KD的发生发展，故推测KD的发生与遗传性有关。髓过氧化物酶(MPO)是在中性粒细胞的嗜天青颗粒中发现的氧化酶，是血红素过氧化物酶家族成员之一，是中性粒细胞活化的标志物，大量研究证实MPO通过氧化参与血管炎症的发生、发展[4]。台湾学者发现该基因与KD易感性相关[5]，大陆仅见熊志[6]、赵宗秀[7]两位学者报道该基因与KD易感性关系，且观点不一致。由于地域及人群的差异，本研究探讨内蒙古中部地区汉族KD儿童的MPO基因rs2333227位点的多态性与KD易感性及其KD临床特点的关联性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年10月至2019年1月连续在内蒙古自治区妇幼保健院住院诊断KD且规范治疗的75例患儿为病例组。在相同时期选择75例在内蒙古自治区妇幼保健院儿保科健康体检儿童为对照组(均排除心、肺、肝、肾及血液系统疾病)。病例组根据心脏超声有无累及冠状动脉，将KD患儿归为CAL组，NCAL组。

川崎病诊断标准[8]：

发热至少五天，至少五种主要临床特征中的四种：

(1)双眼结膜充血，非化脓性；

(2)口腔和嘴唇的变化：裂开和红斑的嘴唇，草莓舌；

(3)多形性皮疹：斑丘疹样、多形性红斑或猩红斑样皮疹等多见，累及四肢、躯干和会阴；

(4)四肢的变化：多在第2周和第3周出现手足红斑，手部和足部硬肿；

(5)常有一侧的淋巴结发生肿大(直径＞1.5厘米)，为非特异性改变。

除外其他系统疾病(如药物过敏、幼年特发性关节炎、葡萄球菌烫伤皮肤综合征、猩红热、病毒感染等确诊为KD。

冠状动脉损害诊断标准[9]：

(1)冠脉内径Z值2.0-2.5是近端冠脉的临界值，故远端冠脉及其他非冠脉血管须大于等于相邻近血管内径的1.5倍被定义为冠脉异常。

(2)依据Z值对冠状动脉异常的分类：①无受累：Z值＜2；②仅扩张：Z值2～＜2.5；或初始Z值＜2，随访中Z值下降幅度≥1；③小型冠状动脉瘤：Z值≥2.5～＜5；④中型冠状动脉瘤：Z值≥5～＜10；且内径绝对值＜8mm；⑤巨大冠状动脉瘤：Z值≥10，或内径绝对值≥8mm。

明确KD诊断后均给予静点丙种球蛋白2g/(kg·d)及口服阿司匹林规范治疗。入选的150例研究对象均为我区无血缘关系的汉族儿童，且籍贯在内蒙古地区，本研究已得到内蒙古自治区妇幼保健院伦理委员会准许，并取得所有研究对象的监护人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 KD 患儿临床资料收集

收集KD患儿发病初期的一般临床资料，包括性别、年龄、皮疹、口腔黏膜病变、手足水肿等症状，以及患儿生化、心脏超声以及影像的资料。

1.2.2 MPO 基因多态性分析

使用一次性含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取研究对象静脉血2mL，对两组血液标本分别标记(病例组A1-A75，对照组D1-D75)，并立即放置在冰箱中-80℃存储，半年内将标本外送至北京六合华大基因公司进行基因测序检测。通过康为世纪生物科技有限公司生产的血液基因试剂盒从血中提取DNA，根据美国国立生物技术信息中心(national center for Biotechnologyinformation，NCBI)公布的MPO基因序列针对rs2333227位点，使用软件Primer Premier 5.0设计含有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的引物，上游引物为：5’-TTCAAGCGATTCTTCTGC-3’；下游引物为：5’-AGGGTCCTCCTTCCTGTG-3’。PCR总反应体系50μL，含有10倍PCR反应缓冲液5μL，dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，EX公司Taq酶1.25U；反应条件：循环条件为：95℃ 15s→(95℃ 15s →50℃ 5s→60℃ 90s)×35cycles→终止反应。分别取2μL扩增的产物利用内切酶BstN I进行酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.3 统计学分析

运用SPSS 20.0 (SPSS Inc.，Chicago，USA)软件进行统计分析。计量资料采用(±s)进行统计描述，正态性检验采用单样本K-S拟合优度法，两组均数的比较采用t检验，不服从正态分布的组间比较采用秩和检验。计数资料采用率进行统计描述，统计推断采用χ2检验。运用Haploview软件进行Hardy-Weinberg平衡定律检验病例组和对照组及CAL和NCAL组，均符合该定律(P＜0.05)。基因型频率和等位基因频率分布应用频数和百分率(%)表示。采用logistic回归分析探讨MPO基因rs2333227位点多态性对KD及KD并发CAL的影响，KD与其基因型及等位基因型患病的相对风险比用比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)表示，其中OR值大于1表示该等位基因或基因型是一个危险因素，危险程度与OR值大小呈正比，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般情况

病例组：男性45例，女性30例，其中0～1岁25例(33.33%)，1～3岁41例(54.67%)，≥3岁9例(12.00%)，年龄为(1.80±1.26)岁。CAL组中男性21例，女性15例，平均年龄为(1.80±1.23)岁；NCAL组中有男性24例，女性15例，平均年龄为(1.79±1.32)岁。

对照组：年龄3月～6岁，其中0～1岁31例(41.33%)，1～3岁35例(46.67%)，≥3岁9例(12.00%)，男性40例，女性35例，年龄为1.78±1.33岁。两组组间年龄和性别比例分布差异均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 病例组与对照组MPO基因

rs2333227位点基因型分布及等位基因频率分布的比较，病例组和对照组MPO基因rs2333227位点等位基因频率分布差异无统计学意义(χ2=2.387，P=0.169)，GG、GA和AA基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=1.316，P=0.339)，详见表1及表2。

表1 病例组和对照组MPO基因rs2333227位点的等位基因频率[n(%)]

表2 病例组和对照组MPO基因rs2333227位点的相关性分析[n(%)]

2.3 MPO 基因多态性与KD 临床特点的相关性

MPO基因rs2333227多态性与KD临床特征的相关性分析结果表明，皮疹、唇及口腔表现、手足症状、球结膜充血、淋巴结肿大、WBC、中性粒细胞百分比、血沉、CRP及BNP在基因型GG和GA+AA组间差异无统计学意义(P＞0.05)，详见表3及表4。

表3 MPO基因rs2333227多态性与KD临床特征的相关性分析[n(%)]

表4 MPO基因rs2333227多态性与KD辅助检查的相关性分析(±s)

表4 MPO基因rs2333227多态性与KD辅助检查的相关性分析(±s)

GG(n=54) GA+AA(n=21) t P WBC(109/L) 15.19±5.60 16.47±6.32 0.625 0.521中性粒细胞百分比(%) 63.21±21.10 58.05±17.08 0.688 0.611血沉(mm/h) 62.40±24.10 64.20±28.00 0.172 0.812 CRP(mg/L) 75.15±40.07 54.15±30.19 1.372 0.192 BNP(pg/L) 862.50±390.85 500.61±218.60 1.767 0.069

2.4 CAL组和NCAL组 MPO基因 rs2333227位点基因型分布及等位基因频率分布的比较

KD中CAL组和NCAL组的MPO基因rs2333227位点等位基因频率分布具有统计学差异(χ2=6.055，P=0.015)，GG、GA和AA基因型频率分布差异具有统计学意义(χ2=7.602，P=0.009)，详见表5及表6。与GA和AA基因型相比，GG基因型增加CAL的发生风险(OR：4.65，95%CI：1.486-14.576)。

表5 KD中CAL组和NCAL组的MPO基因rs2333227位点的等位基因频率[n(%)]

表6 KD中CAL组和NCAL组的MPO基因rs2333227位点的相关性分析[n(%)]

3 讨论

KD的病因尚未明确，近些年来，越来越多的证据表明KD存在明显的种族差异与地域区别，亚裔儿童及亚洲的发病率最高，说明遗传因素可能是发挥了重要作用。其中，关于MPO基因的研究早在2001年因其与冠状动脉疾病的关系较为显著而受到重视。髓过氧化物酶(MPO)是过氧化物酶亚家族的成员，位于人第17号染色体q23区域，分子量为140 kDa，转录产物主要由11个内含子和12个外显子组成，MPO作为白细胞分泌的一种酶，导致氧化过激，过度激活机体免疫应答系统，导致免疫功能紊乱，损伤内皮细胞，最终导致血管炎性改变，其中冠状动脉的损伤较为多见，故MPO的任何异常表达和释放都可能加重炎症和组织的损伤[10]，大量研究证实MPO通过氧化参与血管炎症的发生、发展，是血管炎症的重要生物标志物之一[11]，对早期预警心血管疾病有重要作用。

SU等[12]为了确定MPO是否能识别和确认血管炎小鼠模型中血管壁炎症的部位，在研究26只KD小鼠的过程中，使用血管磁共振成像成功识别了血管炎区域，证实了MPO是血管炎炎症的生物标志物，进一步表明MPO在KD的发生发展中起着重要的作用。这些发现均表明，MPO可能在KD引起的炎症中起重要作用。该位点主要存在于中性粒细胞的溶酶体中，产生高浓度的活性氧，可调控MPO基因的活性，进而过量产生ROS可引起DNA损伤[13]。Piedrafita FJ、Tang等[14-15]发现MPO基因rs2333227位点G等位基因的表达水平较A等位基因强。

近年来，台湾人Weng KP、国内赵宗秀、熊志研究证实[5-7]，MPOrs2333227位点多态性与KD的易感关系较为密切，G的等位基因频率显著高于对照组。本研究结论该基因SNP与内蒙古中部地区汉族儿童的川崎病易感性无明显相关性，结果不尽相同。赵宗秀(研究对象四川成都)认为MPO基因SNP位点多态性可能与KD患儿冠状动脉损伤的发生有关，其中G等位基因可能是风险因子。熊志(研究对象湖北)显示该SNP位点多态性与结膜充血、皮疹、冠状动脉损伤肝脏肿大、脾脏肿大、小叶性肺炎等影像学特点无关，携带有GG基因型的患儿发生手足水肿、腹腔积液的比例较其他基因型患儿高。本研究中发现KD的典型临床表现(如皮疹、唇及口腔表现、手足症状、球结膜充血、淋巴结肿大)中与MPO基因rs2333227位点的各基因型无明显相关性，但携带GG基因型患儿增加CAL的发生风险。临床表现及冠状动脉损害之间的关系结果不完全相同，但均显示GG基因型患儿为高风险因子。

关于基因与KD的易感性及其并发CAL的相关性在国内外近几年已研究发现出多种基因，而目前关于单一致病基因对疾病发生的影响的相关研究可能较少，结合此次研究内蒙古中部地区汉族儿童，样本例数少，实验条件较为局限性，各种与氧化应激有关的生物标志物和中性粒细胞活化也未得到评估，且KD本身存在地区差异，MPO基因SNP rs2333227位点与KD的临床表现及KD并发CAL的关系尚需大样本、多中心的研究，建议进一步对独立大群体进行复制研究。