调环酸钙对盐碱胁迫下不同耐盐性大豆品种根系生长及生理特性的影响

余明龙 靳 丹 刘美玲 李 瑶 郑殿峰 冯乃杰 梁喜龙

(1广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088；2黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163000；3广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518000)

土壤盐渍化已成为当今农业生产无法忽视的难题。盐碱胁迫极大削减了作物的产量，使其产量潜力无法发挥，且在全球变暖的大背景下，干旱、半干旱地区的盐渍化情况日趋加剧[1]。盐碱胁迫是一种复合胁迫，一方面盐分胁迫诱导了渗透胁迫和氧化损伤，另一方面碱分胁迫产生盐分胁迫诱导同样的损伤时，会进一步增强根系对金属离子吸收的抑制，从而加剧植物营养失衡。根系是植物与土壤环境直接接触的器官，长时间暴露在盐碱环境中会因离子毒害导致细胞膜破坏，引起水分和养分吸收障碍，内源激素合成紊乱，最终造成根系和地上部叶片早衰或坏死[2]。大豆(Glyine max)是农业生产中重要的双子叶植物，也是植物蛋白和油脂的主要来源之一，作为一种中等盐敏感作物[3]，盐碱胁迫对大豆的种植面积和产量构成了严重威胁。叶面喷施植物生长调节剂作为一种有效缓解盐碱胁迫对植物不利影响的栽培措施，在提高植物耐性方面具有高效、简便的优势，近年来已得到广泛应用[4－7]。

调环酸钙(3，5－二氧代4－丙酰基环己烷羧酸钙，Prohexadione-Calcium，Pro-Ca)是一种新型的抗赤霉素(gibberellin，GA)植物生长延缓剂，能阻断GA20到GA1的3，β－羟基化来抑制赤霉素的生物合成[8]。因此，探究盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对不同耐盐性大豆根系形态和生理的潜在机制，对提高大豆的盐碱耐性具有重要意义。国内外研究表明，Pro-Ca 在缓解多种非生物胁迫造成的氧化损伤过程中发挥着积极作用。潘明君等[9]研究表明，低温胁迫下叶面喷施Pro-Ca 可显著提高烟草幼苗的根系活力，抑制丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，提高脯氨酸含量，增强超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性。Bekheta 等[10]研究发现，盐胁迫下Pro-Ca 浸种可显著降低蚕豆幼苗的株高，增加地上部干重、脯氨酸、光合色素和可溶性糖含量，显著增强POD 活性，显著降低内源赤霉素和吲哚乙酸的含量。Aghdam[11]研究表明，番茄果实在Pro-Ca 溶液中浸泡5 min 后冷藏21 d，与清水浸泡冷藏处理相比，促进了脯氨酸积累，降低了电解质渗漏率(electrolyte leakage，EL)和MDA 含量。

根系具有吸收、运输、转化和合成营养物质的功能，其生长情况直接影响植物抗逆性，然而，以往关于外源Pro-Ca 提高植物耐盐性的形态和生理机制研究多集中于地上部分且仅考虑单一盐分胁迫，关于Pro-Ca 对盐碱胁迫下植物根系生长和生理代谢影响的研究鲜见报道。本研究以大豆品种合丰50(耐盐)和垦丰16(盐敏感)为试材，探讨叶面喷施Pro-Ca 对盐碱胁迫下大豆根系形态特征、活性氧(reactive oxygen species，ROS)代谢、抗氧化防御系统、膜稳定性和相容性溶质含量的影响，并比较分析Pro-Ca 对不同耐盐性大豆品种在形态和生理上响应策略的异同，以期为改善盐碱地大豆种植、提高大豆产量、实现农业可持续发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16(相对耐盐性通过预试验确定)，供试调节剂为5%Pro-Ca，均由黑龙江八一农垦大学农学院化控实验室提供。

栽培土壤(花土与蛭石的体积比为1 ∶2)含碱解氮91.2 mg·kg－1、速效磷41.5 mg·kg－1、速效钾123.2 mg·kg－1、 有机质25.4 g·kg－1，pH 值6.61。

1.2 试验设计

试验于2019年在黑龙江省大庆市国家杂粮工程技术研究中心盆栽场进行。挑选籽粒均匀饱满的大豆种子，先用无菌水洗涤，再经5% NaClO 消毒2 min，用无菌水彻底洗涤后于室温下干燥1 h。将干燥后的大豆种子均匀播种于双色盆(上部直径25 cm，下部直径15 cm，高度20 cm，底部12 孔，每盆填充1 kg 左右土壤)中，每盆10 粒，不追加施肥。出苗后进行间苗，每盆均保留8 株生长状况相同的幼苗。正常水分管理至幼苗生长到V3 期(第三节期，主茎自初生叶节开始的三个节发育完全)，每品种分别设4 处理，每个处理32盆，即CK:灌溉清水＋喷施蒸馏水；Pro-Ca:灌溉清水＋喷施100 mg·L－1Pro-Ca；SA:灌溉110 mmol·L－1盐碱溶液(NaCl ∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3＝9 ∶1 ∶9 ∶1，pH 值8.42)＋喷施蒸馏水；SA＋Pro-Ca:灌溉110 mmol·L－1盐碱溶液＋喷施100 mg·L－1Pro-Ca。

前期研究得出100 mg·L－1Pro-Ca 对缓解大豆幼苗盐碱胁迫的调控效果最好[12]。在胁迫开始时，为避免盐冲击效应，盐碱浓度按每天30、70、110 mmol·L－1递增，到达110 mmol·L－1后作为第1 天，并且在达到预定盐碱浓度的同时叶面喷施100 mg·L－1Pro-Ca，每组仅喷施等量蒸馏水或Pro-Ca 一次，均匀喷洒至每片叶子的正反面以湿润不流滴为宜。此后每隔1 d 定时定量用110 mmol·L－1盐碱溶液进行浇灌，浇灌量为持水量的3 倍，约2/3 的溶液流出，从而将积累的盐冲洗掉，以保持盐浓度恒定(对照浇灌等量清水)，试验采用完全随机设计，3 次重复。在盐碱胁迫处理开始前取样一次，记做BSA，随后分别在喷施Pro-Ca 后3、6、9、12 和15 d 取样，取样部位均为倒三功能叶(第一片完全展开的三出复叶)，样品用液氮冷冻，保存于－40℃冰箱待测。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 幼苗生长指标 110 mmol·L－1盐碱胁迫后15 d，在不破坏根系的情况下，将大豆幼苗从土壤中完整取出，用去离子水冲洗干净，再用滤纸擦干水分，立即测定根长、地上部鲜重和根鲜重。然后将其于烘箱中105℃杀青30 min，75℃烘干至恒重，测量地上部干重和根干重。

1.3.2 生理生化指标 分别于盐碱胁迫前(BSA)和110 mmol·L－1盐碱胁迫后3、6、9、12 和15 d 进行根系取样，电解质渗漏率参考Gupta 等[13]的方法测定；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定，产生速率采用对氨基苯磺酸法测定，过氧化氢(H2O2)含量采用碘化钾显色法测定，抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)含量采用4，7－二苯基－1，10－菲咯啉(4，7-diphenyl－1，10-phenanthroline，BP )显色法测定，谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量采用5，5－二硫代双－2－硝基苯甲酸[5，5′-Dithiobis－(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]显色法测定，可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定[14]； SOD、POD、CAT 和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性根据Liu 等[15]的方法测定。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 对试验数据进行录入、统计，运用SPSS 26.0 单因素方差(ANOVA)分析和Duncan’s 多重比对法对数据进行统计分析，采用Origin 2019 进行绘图。数据以均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆生长的影响

由表1 可知，盐碱胁迫处理对大豆幼苗的生长具有显著的不利影响，耐盐品种合丰50 的根长、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重分别较CK 降低了15.9%、18.0%、24.6%、27.6%和40.3%，盐敏感品种垦丰16 分别较CK 降低了26.6%、16.3%、16.2%、11.4%和29.5%。叶面喷施Pro-Ca 缓解了盐碱胁迫对大豆幼苗生长的抑制，与SA 相比，耐盐品种合丰50根长、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重分别增加了11.2%、7.1%、3.2%、18.8%和38.0%，垦丰16分别增加了23.6%、10.6%、19.8%、6.1%和37.6%，表明喷施Pro-Ca 能促进盐碱胁迫下大豆幼苗的生长，且对耐盐品种合丰50 干物质的增加效果大于盐敏感品种垦丰16。

2.2 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆根系电解质渗漏率和MDA 含量的影响

由图1 可知，与CK 相比，盐碱胁迫下大豆根系电解质渗漏率和MDA 含量随胁迫时间延长明显增加。耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 根系的电解质渗漏率分别较CK 增加2.9～29.0 和15.8～36.1 个百分点，MDA 含量分别较CK 增加5.8% ～ 47.8%和6.5%～69.1%。说明大豆根系细胞膜在盐碱胁迫条件下遭受了严重的氧化损伤，且对盐敏感大豆品种造成的伤害高于耐盐大豆品种。喷施Pro-Ca 降低了盐碱胁迫下大豆根系电解质渗漏率和MDA 含量，耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 大豆根系的电解质渗漏率分别较SA 降低1.6～27.0 和0.3～24.5 个百分点，MDA 含量分别较SA 降低1.2%～5.0%和3.7%～23.4%。综上表明，外源Pro-Ca 具有降低大豆根系膜脂过氧化作用的能力，从而在维持膜系统完整性中发挥积极作用，且对盐敏感品种垦丰16 的降低效果高于耐盐品种合丰50。

2.3 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆根系生速率和H2O2 积累的影响

2.4 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆根系抗氧化酶活性的影响

由图3 可知，盐碱胁迫(SA)下，耐盐品种合丰50根系的SOD、POD 和APX 活性均随胁迫时间延长呈增加趋势，CAT 活性在处理9 d 后逐渐降低，但活性始终高于CK；盐敏感品种垦丰16 的4 种抗氧化酶活性均随胁迫时间延长呈先增加后降低的趋势，且在胁迫后15 d 均低于CK。表明相比于盐敏感品种垦丰16，耐盐品种合丰50 能诱导更高的抗氧化酶活性以应对盐碱胁迫。SA＋Pro-Ca 能进一步提升合丰50 和垦丰16 根系的SOD、POD、CAT 和APX 活性，与SA 相比，耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 的根系SOD活性分别增加14.3%～161.8%和4.1%～23.6%，POD活性分别增加4.4%～25.6%和0.3%～18.1%，CAT 活性分别增加3.4%～36.8%和2.8%～36.1%，APX 活性分别增加4.5%～28.1%和2.6%～35.2%。说明盐碱胁迫下喷施适宜浓度的Pro-Ca 可以增加大豆根系的抗氧化酶活性，有利于清除ROS，增强根系对盐碱环境的耐受能力。

2.5 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆根系AsA 和GSH 含量的影响

由图4 可知，与CK 相比，盐碱胁迫提高了2 个大豆品种根系的AsA 含量，但均未达到差异显著水平；合丰50 根系GSH 含量在胁迫后9～15 d 显著低于CK，而垦丰16 根系GSH 含量仅在胁迫后15 d 显著低于CK。与SA 相比，SA＋Pro-Ca 处理合丰50 和垦丰16根系的AsA 含量均有所增加，但差异不显著；合丰50根系GSH 含量在胁迫后9 和12 d 分别较SA 显著增加27.9%和13.1%，垦丰16 根系GSH 含量在胁迫后15 d 较SA 显著增加53.5%。与CK 相比，单独喷施Pro-Ca 也能在一定程度上增加大豆根系AsA 含量，但会降低大豆根系GSH 含量。

2.6 盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 对大豆根系渗透调节物质含量的影响

由图5 可知，盐碱胁迫下2 个大豆品种根系的可溶性蛋白含量均随胁迫时间延长呈先上升后下降的趋势，且垦丰16 根系的可溶性蛋白含量在胁迫后15 d显著低于CK；而在盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 可明显提高大豆根系可溶性蛋白含量，分别较SA 增加6.6%～17.8%(合丰50)和3.8%～10.4%(垦丰16)。与CK相比，SA 和SA＋Pro-Ca 的可溶性糖和脯氨酸含量均有所增加，但SA＋Pro-Ca 比SA 积累了更高的可溶性糖和脯氨酸含量，SA＋Pro-Ca 的可溶性糖含量分别较SA增加5.1%～7.8%(合丰50)和6.2%～28.0%(垦丰16)，脯氨酸含量分别增加19.1%～31.9%(合丰50)和6.9%～27.8%(垦丰16)。正常条件下喷施Pro-Ca也对耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 根系的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量具有一定影响，但从整个取样进程来看总体与CK 差异不显著。上述结果表明叶面喷施Pro-Ca 能促进盐碱胁迫下大豆根系渗透调节物质的生物合成，缓解胁迫对根系的损伤，维持细胞膨压，促进根系吸水。

2.7 主成分分析

对2 个大豆品种4 个处理的16 个耐盐碱指标进行主成分分析(principal components analysis，PCA)，结果如表2 所示。提取了特征值>1 的主成分，耐盐品种合丰50 的第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)和第三主成分(PC3) 方差贡献率分别为59.188%、16.955%和9.715%，而盐敏感品种垦丰16 的PC1、PC2 和PC3 的方差贡献率分别为43.729%、21.950%和19.033%，耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16的总方差解释率均大于80%，说明3 个主成分可以较为完整的反映Pro-Ca 对大豆根系耐盐性的不同信息。

表2 总方差解释Table 2 Total variance explained

由图6 可知，耐盐品种合丰50 的PC1 系数为正且载荷值较高的指标有电解质渗漏率、MDA、H2O2、SOD、POD、APX 和可溶性糖，说明PC1 的各项指标可概括为抗氧化酶和膜脂过氧化相关因子；PC2系数为正且载荷值较高的指标有CAT、AsA、可溶性蛋白和脯氨酸等，说明PC2 的各项指标可概括为渗透调节相关因子。而盐敏感品种垦丰16 的PC1 系数为正且载荷值较高的指标有、H2O2、AsA、可溶性糖和脯氨酸，说明PC1 的各项指标可概括为ROS 和渗透调节相关因子；PC2 系数为正且载荷值较高的指标有根鲜重、根干重、根长和可溶性蛋白，说明PC2 的各项指标可概括为根系生长相关因子。

以主成分综合得分评价Pro-Ca 对不同耐盐性大豆品种相关耐盐因子的影响，结果如图7 所示。在盐碱胁迫条件下，叶面喷施Pro-Ca 耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 的主成分综合得分比BSA 分别增加6.8%～150.6%和1.3%～421.9%。由此可知，叶面喷施适宜浓度Pro-Ca 能提高大豆根系的耐盐性能力，且对不同耐盐性大豆品种均具有明显的正向调控作用。

3 讨论

盐碱胁迫对大豆生长和生产产生的负面影响表现在盐度诱导的高渗透压(低水分利用效率)和碱度导致高pH 值的离子毒害综合效应[16]。根系是植物最先感受土壤盐碱化的器官，根系生长受抑制是盐胁迫下植物最早和最明显的症状[17－18]。本研究发现，与正常生长的处理(CK)相比，盐碱胁迫抑制了大豆生长参数的增加，降低了根长、地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重，且对盐敏感品种垦丰16 的抑制作用强于耐盐品种合丰50。盐碱胁迫下叶面喷施适宜浓度的调环酸钙(Pro-Ca)明显改善了盐碱胁迫对大豆生长的抑制作用，表现为根长、地上鲜重、根鲜重、地上干重和根干重均有所增加，说明外源Pro-Ca 对盐碱胁迫下大豆根系生长具有正向调控作用。这与Bekheta 等[10]在蚕豆上的研究结果一致。

ROS 是一把双刃剑，在植物响应环境胁迫中发挥着双重作用，主要取决于ROS 在产生和猝灭之间的微妙平衡是否被打破[19－20]。低水平的ROS 在植物的代谢过程中发挥信使的作用，传递胁迫信息，促使植物做出适应性反应以应对不良环境。然而，在持续的胁迫条件下，植物体内开始逐渐积累大量的ROS(如1O2、、H2O2和HO·)，进一步加剧膜脂过氧化作用诱导MDA 含量增加，造成细胞膜损伤，表现为电解质渗漏率增加[21－22]，而电解质渗漏率和MDA 含量的变化可以反映细胞膜对胁迫环境的抵抗能力和损伤程度[23]。本研究结果表明，与CK 相比，大豆根系的产生速率和H2O2含量在盐碱胁迫下随处理时间延长明显增加，电解质渗漏率和MDA 含量也同步增加，盐敏感品种垦丰16 相较与耐盐品种合丰50 产生了更高水平的和H2O2，说明盐碱胁迫打破了细胞间ROS 的代谢平衡，盐敏感品种垦丰16 比耐盐品种合丰50 在盐碱胁迫下遭受了更为严重的氧化损伤，也从侧面说明耐盐品种根系膜系统受到外界环境的伤害较小，能够保持较高的相对完整性，间接地体现出较好的耐盐碱性，这与前人的研究相一致[24－27]。

抗氧化防御是植物抵御氧化胁迫的一种重要潜在机制，由SOD、POD、CAT 和APX 等酶类抗氧化剂和AsA 和GSH 等非酶抗氧化物质两部分组成[28－31]。本研究发现，在盐碱胁迫下，耐盐品种合丰50 根系的SOD、POD、CAT 和APX 活性总体均高于CK，而垦丰16 根系的SOD、POD、CAT 和APX 活性均随胁迫时间延长呈先上升后下降的趋势并最终低于CK。此外，两品种根系的AsA 含量在整个处理阶段呈增加趋势，而GSH 含量呈降低趋势，说明大豆根系的抗氧化防御系统被激活以响应盐碱胁迫，然而，这种反应机制在盐敏感品种垦丰16 中可能随盐胁迫时间延长而受到抑制。与盐碱处理相比，叶面喷施Pro-Ca 改善了这种状况，提高了2 个大豆品种根系的SOD、POD、CAT 和APX活性，AsA 和GSH 含量也同时增加；另外，SA＋Pro-Ca显著降低了盐碱胁迫条件的产生速率和H2O2含量，削弱了膜脂过氧化作用，减少了MDA 的产生，进而降低了电解质渗漏率。以上结果表明，外源Pro-Ca能增强大豆根系抗氧化系统活性，缓解盐碱胁迫诱导的氧化伤害，从而保护根系的结构和功能，促进根系生长。

盐胁迫下植物通过增加细胞中相容性溶质含量来维持渗透平衡并支持水分的吸收[32－33]。脯氨酸和可溶性糖是2 种重要的渗透调节溶质，有利于细胞溶胶中的代谢稳定，保持细胞膨压，此外，脯氨酸还可以作为ROS 的清除剂，与抗氧化酶协同作用降低植物体内的ROS[34]。可溶性蛋白不仅可以作为渗透调节剂参与渗透调节，还能反映植物器官的损伤程度[35]。本研究中，盐碱胁迫下2 个大豆品种根系中的脯氨酸和可溶性糖含量均增加，从而使植物根系细胞维持较低的渗透势来刺激水分吸收，保证了植物在盐碱胁迫条件下正常生长。大量研究已经证明，植物受到胁迫会导致蛋白质的生物合成受阻或加速蛋白质的降解[36－37]，由于可溶性蛋白降解会产生大量的游离氨基酸，而脯氨酸是各种作物中第一批迅速增加的氨基酸之一，因此根系中脯氨酸含量的增加可能与蛋白质分解有关[38]。盐碱胁迫下喷施Pro-Ca 均诱导了耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 根系可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量增加，但耐盐品种合丰50 在处理后期脯氨酸含量明显低于盐敏感品种垦丰16，可能是由于耐盐品种比盐敏感品种合成了更高的可溶性蛋白含量；此外，Cao 等[39]研究也表明盐胁迫下盐敏感品种比耐盐品种积累更多的脯氨酸。综上表明，Pro-Ca 可通过促进渗透保护剂的积累来调节根系水势并保护根系功能，从而缓解盐碱胁迫的不利影响。

植物的耐盐碱性与诸多因素有关，简化指标不能准确反映其调控能力，因此，需对Pro-Ca 赋予植物的耐盐碱性进行多指标综合评价，从而明确其对不同耐盐性植物的调控机制和调控能力。通过PCA 对耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 分别提取了总贡献率为85.858%和84.711%的3 个主成分，对3 个主成分进行可视化分析发现，Pro-Ca 通过增强共同的防御机制，即降低ROS(、H2O2)积累，增强渗透调节和抑制膜脂过氧化作用来提高2 个大豆品种的耐盐碱性，但不同的是，Pro-Ca 主要通过激活抗氧化酶(SOD、POD、CAT 和APX)途径提高耐盐品种合丰50 的耐盐碱性，却通过改善根系表型(根鲜重、根干重和根长)提高盐敏感品种垦丰16 的耐盐碱性。此外，Pro-Ca 对不同耐盐性大豆品种根系耐盐碱性的主成分综合得分进一步表明其对耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 根系均具有较好的调控效果。以上试验结果表明，Pro-Ca 通过不同的耐盐机制共同赋予了不同耐盐性大豆品种根系独特的适应盐碱化生境的生理机制。

4 结论

叶面喷施Pro-Ca 处理可有效地促进盐碱胁迫下不同耐盐性大豆品种根系生长和生物量的积累，上调抗氧化酶活性和非抗氧化物质含量，增强活性氧清除能力，并能加速相容性溶质(可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸)的生物合成，维持根系渗透压，减少盐碱胁迫下电解质外渗，从而缓解盐碱胁迫对根系造成的伤害。主成分分析表明Pro-Ca 对耐盐品种合丰50 和盐敏感品种垦丰16 均具有较好的调控效果。