湿度对甘薯愈伤的影响

魏 蕾 刘开梦 董中富 徐静嶷 吴怡娇 熊春雨 孙 洁 王彩霞

(1四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2农业农村部规划设计研究院，北京 100125)

甘薯(Ipomone batatasL)，又称红薯、番薯，是世界第七大、我国第四大粮食作物。新鲜甘薯块大、皮薄、肉嫩，在采收、贮运及销售过程中容易造成机械损伤，导致病菌侵染，降低耐贮性[1]。研究表明，每年约有15%的甘薯因贮藏不当而霉烂，其中因机械损伤造成病原菌入侵引起的霉烂占总损失的一半以上[2]。

甘薯受到机械损伤后，若在适宜的环境条件下，伤口部位薄壁组织细胞会积累聚酚和聚酯类物质，推动木栓化进程，形成愈伤组织[3]。愈伤组织能有效阻止水分蒸腾、氧化变质及病原菌侵入，并减少重量损失，维持品质[4]。

采后愈伤处理是一些果蔬保持品质、减少腐烂变质以及延长贮藏期所采取的必要措施[5]。甘薯贮藏前，进行适当的愈伤处理极为重要。愈伤组织的形成在很大程度上受环境因素的影响，如温度、湿度。传统的甘薯愈伤方式主要有两种:一是采挖后田间自然晾晒愈伤，二是在专门的愈伤库内控制温度、湿度实现人工快速愈伤。第一种方式因甘薯产地气候条件不同，愈伤时间和愈伤效果差异较大。近年来，条件可控的第二种愈伤方式受到了广泛关注，但各地采用的愈伤条件不尽相同，尤其湿度差异较大，如Yin 等[6]认为甘薯适宜的愈伤条件为28.5℃、相对湿度(relative humidity，RH)85%；Nabubuya 等[7]发现甘薯在29～31℃、RH63%～65%条件下愈伤后贮藏效果较好。湿度是影响愈伤组织形成的重要因素。一般高湿有利于愈伤组织形成，但高湿也为细菌繁殖提供了有利条件，甘薯易发软腐病[8]。目前，关于湿度对甘薯愈伤的研究尚鲜见报道。本试验拟针对湿度对甘薯愈伤的影响展开研究，从愈伤组织木质素积累、失重、呼吸强度、酶活、愈伤次生代谢产物等角度阐述湿度对愈伤组织形成的影响，并探讨相关机理，旨在为采后甘薯愈伤提供新的方法和依据，降低甘薯在贮藏过程中的腐烂率，提高甘薯的贮藏效果及食用品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普薯32 号购于漳州悯农闽味生态农业科技有限公司，选择外观整齐、大小均匀(250±50 g)、无损伤无病虫害的新鲜甘薯，采挖后运回实验室，清洗晾干备用。

乙酰溴、β－巯基乙醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正己烷、盐酸羟胺、无水甲醇、聚乙烯吡咯烷酮K30，成都科隆化学品有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 主要设备与仪器

E200 光学显微镜，尼康仪器有限公司；LHS－250SC 恒温恒湿培养箱，上海浦东荣丰科学仪器有限公司；X3R 高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司；UV－1800PC 紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 愈伤处理 甘薯清洗后用1%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，蒸馏水冲洗后晾干备用。用消毒后的擦皮刀在甘薯表面中部分别擦伤2 道长40 mm、宽10 mm、深2 mm 的伤口，将损伤甘薯分别置于25±5℃、RH50%±5%和RH80%±5%的培养箱中愈伤。每处理甘薯100 个，重复3 次。

1.3.2 取样 分别在愈伤第0、第2、第4、第6 和第8天采用手术刀取损伤部位及皮下2 mm 处的薯肉组织，锡箔纸包裹后快速冻结并置于－80℃的超低温冰箱，备用。

1.3.3 木质素含量的测定 参照Yin 等[9]的方法并作修改。取冷冻的愈伤组织1 g，加入6 mL 4℃预冷的95%乙醇，冰浴下研磨成浆，4℃、8 000 r·min－1条件下离心30 min，弃上清，沉淀用3 mL 95%乙醇冲洗3 次后，再用3 mL 乙醇∶正己烷＝1 ∶2(v∶v)的溶液冲洗3次，收集沉淀并干燥至恒重，干燥物溶于1 mL 25%溴化乙酰冰醋酸溶液，于70℃水浴30 min，然后加入1 mL 2 mol·L－1NaOH 溶液中止反应，再加入0.1 mL 7.5 mol·L－1羟胺盐酸和2 mL 冰醋 酸，于4℃、8 000 r·min－1条件下离心30 min，取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm 波长处测定其吸光度值，重复3 次。木质素含量用OD280·g－1表示，以鲜重计。

1.3.4 木质素积累量的测定 参照姜红[10]的方法，在愈伤第0、第4、第8 天染色观察甘薯愈伤组织部位木质素积累量并拍照。

1.3.5 失重率的测定 采用称量法[11]测定甘薯失重率。

1.3.6 呼吸强度的测定 采用静置吸收法[12]测定整甘薯的呼吸强度，单位以mg·kg－1·h－1表示。

1.3.7 苯丙氨酸解氨酶活性的测定 参照王鸿飞等[13]的方法，稍作修改。称取冷冻愈伤组织3 g，加入15 mL 提前预冷的0.1 mol·L－1硼酸缓冲液(pH 值8.8，含1 mmol·L－1EDTA 和50 mmol·L－1β－巯基乙醇)，冰浴研磨成浆，4℃、8 000 r·min－1条件下离心30 min，取上清液量其体积后用于酶活性测定。反应体系:在100 μL 粗酶液加入3.9 mL 0.1 mol·L－1硼酸－硼砂缓冲液(pH 值8.8)、1 mL 0.6 mol·L－1L－苯丙氨酸溶液，混匀后于40℃保温1 h，加入0.2 mL 2 mmol·L－1盐酸终止反应，在290 nm 波长处测定其吸光度值A290nm。单位以每小时290 nm 波处吸光度值增加0.1为1 个活性单位(U)，记为U·h－1·g－1。

1.3.8 过氧化物酶活性的测定 采用愈创木酚法[12]测定甘薯愈伤组织部位过氧化物酶活性。单位以每分钟470 nm 波长处吸光度值上升0.1 为1 个活性单位(U)，记为U·min－1·g－1。

1.3.9 多酚氧化酶活性的测定 采用邻苯二酚法[12]测定甘薯愈伤组织部位多酚氧化酶活性。单位以每分钟420 nm 波长处吸光度值上升0.1 为1 个活性单位(U)，记为U·min－1·g－1。

1.3.10 总酚、类黄酮含量的测定 根据Yin 等[9]的方法并做修改。取冷冻的愈伤组织1 g，加入5 mL 4℃预冷的1% 盐酸－甲醇，冰浴研磨成浆，暗处反应20 min后，4℃、8 000 r·min－1条件下离心30 min，取上清液分别在280 nm 和325 nm 波长处测定其吸光度值，总酚和类黄酮含量分别用OD280·g－1和OD325·g－1表示，以鲜重计。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010 软件处理数据，计算其平均值、标准误差，采用SPSS Statistics 18.0 软件进行显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 湿度对甘薯木质素生成的影响

木质素是果蔬损伤愈合过程中由肉桂醇、咖啡醇等木质素单体聚合而成的复合物，具有防止水分及养分流失、抵抗病菌侵染的作用。木质素的生成量和积累时间可作为伤口愈合程度的判定依据[14]。由图1 可知，愈伤期间，两组湿度条件下的甘薯木质素含量均随愈伤时间延长呈先上升后下降的趋势，RH80%愈伤组甘薯的木质素含量始终高于RH50%愈伤组，第4 天时，RH80%愈伤组甘薯的木质素含量比RH50%组高20.69%。由图2 可知，在愈伤过程中，RH80%愈伤组甘薯伤口处的木质素染色始终深于RH50%愈伤组，愈伤4 d 的效果更为明显，其染色更深、宽度更大，这与木质素含量结果一致，即高湿条件有利于甘薯损伤部位木质素的生成，加速木栓化进程，促进伤口愈合。

2.2 湿度对甘薯失重率的影响

当甘薯遭受机械损伤后，会加速其水分流失，导致重量损失严重。愈伤组织能有效阻止水分蒸发散失，其愈合程度越高，水分蒸发越慢，失重率越低[4]。由图3 可知，在愈伤期间，两组湿度条件下甘薯的失重率均随愈伤时间延长逐渐升高，RH80%愈伤组甘薯的失重率显著低于RH50%愈伤组。高湿愈伤有利于降低甘薯失重率主要归结于两方面:一是高湿条件下水分蒸腾速率低；二是高湿加速了甘薯愈伤组织的形成，延缓了水分从机械伤口蒸发的速度。说明甘薯在高湿环境中愈伤能有效降低蒸腾作用，减少重量损失，延缓品质下降。

2.3 湿度对甘薯呼吸强度的影响

机械损伤引起的呼吸强度变化与植物体内的代谢活动密切相关，呼吸作用为愈伤相关的代谢活动提供物质和能量[15]。由图4 可知，在愈伤期间，RH80%愈伤组甘薯在第2 天呼吸强度达到最高峰后缓慢下降，RH50%愈伤组甘薯呼吸强度在第4 天达到顶峰后下降。表明甘薯在高湿条件下呼吸高峰提前，损伤部位的新陈代谢加快，及时为伤口愈合提供了底物和能量，促进了愈伤组织形成。

2.4 湿度对甘薯酶活性的影响

苯丙烷代谢在愈伤过程中发挥着重要作用[16]。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase，PAL)是苯丙烷代谢关键限速酶，伤口部位PAL 活性的提高可促进酚类物质的积累[17]。由图5-A 可知，在愈伤过程中RH80%愈伤组甘薯PAL 活性显著高于RH50%愈伤组，愈伤4 d 时，RH80%愈伤组甘薯PAL 活性达到最高值，比RH50%愈伤组高22.49%，表明RH80%愈伤处理对甘薯PAL 活性的提高起到了促进作用。植物遭受机械损伤后可激活细胞壁中的过氧化物酶(peroxidase，POD)，催化受伤处细胞壁组分形成一层不透水、不透气的屏障，加快受伤细胞壁的修复和新细胞壁的合成。有研究表明，POD 活性的升高有利于植物木质素和植保素的生成，可促进快速愈伤[18]。由图5-B 可知，甘薯POD 活性变化呈单峰型变化趋势，愈伤2～8 d 时，RH80%愈伤组甘薯POD 活性均显著高于RH50%愈伤组；且在愈伤4 d 时，RH80%愈伤组甘薯POD 活性急剧升高至最大值，较RH50%愈伤组高46.41%，说明甘薯在高湿条件下愈伤能有效提高POD活性。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)可以催化酚类物质氧化形成醌。醌是一类比酚氧化能力更强的物质，能直接抑制病原菌的生长，对愈伤组织的形成也具有帮护作用[19]。由图5-C 可知，两组湿度条件下甘薯PPO 活性变化趋势与PAL、POD 活性基本一致，愈伤4 d 时，RH80%愈伤组甘薯PPO 活性较RH50%愈伤组高21.68%。因此，甘薯于RH80%条件下愈伤在一定程度上有利于PPO 活性的增加。甘薯酶活性试验结果与木质素生成的结果一致，说明甘薯于高湿环境下愈伤，其PAL、POD、PPO 活性升高，有利于木质素大量沉积，加速细胞壁木栓化进程，强化了甘薯细胞壁，对甘薯伤口快速愈合十分有利。

2.5 湿度对甘薯总酚含量的影响

酚类物质作为木质素合成的前体物质，具有较强的抗氧化能力，不仅可以抑制病原菌通过伤口侵染果实，而且可参与愈伤组织的形成[17]。由图6 可知，两组湿度条件的甘薯总酚含量在愈伤第4 天时达到顶峰，RH80%愈伤组甘薯总酚含量比RH50%愈伤组高16.15%，随后总酚含量开始下降，这是由于PPO 将酚类物质氧化成醌类物质，以降低甘薯被侵染的程度[20]。可见，甘薯在高湿环境下愈伤能促进酚类物质的积累，增强抗氧化能力。

2.6 湿度对甘薯类黄酮含量的影响

类黄酮是一类重要的植保素，能有效抑制病原物的扩展，其产生速率和积累量常作为评价植物抗病性的重要指标[21]。由图7 可知，两组甘薯的类黄酮含量变化趋势整体一致，前期逐渐上升后期缓慢下降，于第4 天达到最大值，且RH80%愈伤组甘薯类黄酮含量比RH50%愈伤组显著提高17.05%。说明甘薯在高湿条件下愈伤生成的类黄酮含量高，其抗病性强。

2.7 高湿处理后甘薯木质素含量、酶活性及代谢产物之间的相关性分析

由表1 可知，高湿条件下(RH80%)甘薯PAL 活性与PPO 活性呈极显著正相关，表明PPO 活性在催化苯丙烷代谢途径发展中做出了积极贡献。高湿条件下 甘薯木质素含量与PAL 活性、POD 活性、PPO 活性、总酚含量、类黄酮含量呈显著正相关，说明PAL、POD、PPO 活性的激活以及总酚、类黄酮含量的生成和积累对甘薯木栓化组织的形成发挥着重要作用。甘薯在高湿条件下POD 活性与总酚、类黄酮含量之间呈显著正相关，可见POD 活性的提高对植保素总酚、类黄酮含量的增加起到了积极作用。

表1 RH80%甘薯木质素含量、酶活性及代谢产物之间的相关性Table 1 Correlation among lignin content，enzyme activity and metabolites of RH80%sweet potato

3 讨论

湿度是影响愈伤组织形成的重要影响因素[22]。本研究发现，在RH80%条件下对甘薯进行愈伤处理，可有效活化苯丙烷代谢关键酶PAL、POD、PPO，增进次生代谢产物木质素、总酚、类黄酮的积累，对甘薯愈伤组织形成起到促进作用。

愈伤是甘薯受到损伤后对外界环境做出的应激反应。环境中的温度、湿度对愈伤组织的形成有较大影响。本研究发现，甘薯于RH80%条件下愈伤能有效减少甘薯重量损失，原因可能是高湿条件下甘薯体内水分蒸发较少以及该条件下利于木栓层形成从而减少水分从损伤部位散失。该结果与贾雯茹等[23]在高湿贮藏条件下减轻黄瓜果实冷害的研究结果相符。苯丙烷代谢途径是植物重要的次生代谢途径之一，PAL 是苯丙烷代谢的限速酶，可催化苯丙烷代谢的第一步反应，使L－苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸[24]。反式肉桂酸经过一系列反应后生成多酚和类黄酮等愈伤组织的基本成分[17]。酚类物质本身具有抗病性，可作为病原物的拮抗剂，同时又作为合成木质素的前体物质。木质素是甘薯伤口愈合过程中形成的一种甘油酚－脂类聚合物，甘薯伤口部位发生木质化即形成愈伤组织，总酚和木质素含量的增加有利于甘薯伤口修复[12]。类黄酮在果蔬受到伤害时能有效抵抗病原物的侵染[25]。本研究中，甘薯在高湿环境中愈伤所产生的木质素、总酚及类黄酮含量的整体变化趋势与PAL 活性变化结果基本一致，这可能与甘薯伤口部位PAL 活性调控相关。可见，高湿环境中愈伤能促进甘薯伤口部位苯丙烷代谢酶活性提高和次生代谢产物含量增加。

POD 和PPO 是苯丙烷代谢途径的2 种末端酶。POD 在果蔬体内参与膜脂过氧化，可催化分解过氧化氢使木质素单体发生聚合而参与木质素的合成，促进愈伤组织的形成[26]。本研究发现，甘薯在高湿环境中愈伤利于POD 活性的提高，这与薛婧[27]研究山药贮藏的结果类似。PPO 不仅是植物体内重要的次生代谢酶，能催化木质素形成，促进细胞壁木质化以抵抗病原菌的侵染，还参与活性氧的代谢，生成氧中间体，在防御机制中起重要作用[28]。本研究发现，高湿处理在一定程度上促进甘薯愈伤期间PPO 活性升高，这与陈国刚等[29]在库尔勒香梨上的研究基本一致。范存斐等[30]认为苯丙烷代谢途径的激活可能与该途径中多种编码抗性酶防卫基因的表达增强有关。本研究中高湿条件下苯丙烷代谢增强可能也与高湿环境中此类基因的表达活跃相关，具体机理还需要进一步研究。此外，高湿环境对愈伤甘薯活性氧代谢、能量代谢的影响及机制仍有待深入探索。

4 结论

本研究结果表明，与低湿(RH50%)相比，采后受到机械损伤的甘薯在高湿(RH80%)条件下愈伤可提高木质素累积、降低失重率。高湿条件可促进甘薯呼吸高峰提前，提高苯丙烷代谢关键酶PAL、POD、PPO的活性以及次生代谢产物总酚和类黄酮的含量。因此，采后高湿条件有利于激发甘薯损伤部位的苯丙烷代谢，加速机械损伤甘薯愈伤组织的形成。