我国有机茶稳定同位素特征与δ15N标识相关性研究

李春霖 汪秋红 聂 晶 周燕君 邵圣枝 袁玉伟 傅尚文 王 钫

(1浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021；2中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3农业农村部农产品信息溯源重点实验室，浙江 杭州 310021)

我国有机茶产业特色鲜明，发展迅速。2015年至2018年我国有机茶生产面积由4.4 万公顷增长至11.1 万公顷，增幅达152%[1]。2018年我国有机茶产量为19.3 万吨，占我国茶叶总产量的7.4%[2]。我国农业行业标准NY 5196－2002[2]规定，有机茶在生产过程中不得使用农药和化肥等化学合成物质。由于有机茶的生产及认证成本较高，其市场售价通常高于常规生产的成品茶，有机茶仿冒问题时有发生，因此有机茶产品的监管与鉴定工作十分重要。目前有机茶认证检测主要集中于农药残留和重金属等安全指标，尚无有效的检测方法对施肥种类进行判别。

植物稳定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)能反映植物生长过程中的环境因素差异，已在农产品的真实性鉴别和生产方式鉴别中有一定的应用研究[3－4]。已有研究表明δ15N 可以作为区分常规种植和有机种植产品的重要指标之一[5]。有机肥中15N 通过氨挥发、反硝化等化学反应发生明显富集[6]，对生长中作物的δ15N 产生影响。研究发现在蔬菜[7]、大米[8－9]、小麦[10]、葡萄酒[11]和橄榄油[12]等农产品中，有机产品的δ15N 通常高于常规产品。关于有机茶δ15N 标识的相关研究较少，已有学者测得日本有机茶和常规茶的δ15N 分别为6.8‰和4.2‰，具有显著差异[13]。另有研究表明，茶叶中δ15N 与有机栽培时间有关[14]。同时，有机栽培会影响植物的光合作用、呼吸作用以及蒸腾作用等[15－16]，这些生理代谢活动会造成植物碳、氢、氧同位素发生分馏。碳同位素比率(δ13C)主要取决于植物光合作用类型和速率，与环境中光照、温度、CO2等因素有关[17]。植物有机物中氧同位素比率(δ18O)则与CO2等光合作用参数以及降水等因素有关[18]。氢同位素比率(δ2H)与降雨、湿度、气孔开合等密切相关[19]。现有报道表明利用稳定同位素技术可以开展有机农产品的真实性鉴别[20]，在有机茶鉴别方面具有可行性。

目前我国有机茶中稳定同位素特征分布情况尚不清楚，δ15N 作为有机鉴别标识的影响因素有待进一步研究。本研究首次广泛收集全国范围内有机茶认证企业的样品，分析稳定同位素特征(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)，探究标识特征δ15N 的变化规律及其主要影响因素，旨在为有机茶认证的市场监管和消费者权益保障提供技术支撑与科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验材料为145 个有机茶样品，来自全国13 个省，涉及39 个地市及自治州，由全国102 家有机茶认证企业提供，均为在售成品茶。样品详细来源信息见表1。其中2018年各省份有机茶生产面积数据来源于国家市场监督管理总局[1]。

表1 有机茶样品来源信息表Table 1 Information of the organic tea samples

稳定同位素标准物质，IAEA-CH － 6 (蔗糖，δ13CV-PDB＝－10.45‰ ± 0.03‰)、IAEA-N－2(硫酸铵，δ15Nair＝20.30‰ ± 0.20‰)，购于国际原子能机构(IAEA，奥地利)；B2155(酪蛋白，δ13CV-PDB＝－26.98‰± 0.13‰，δ15Nair＝5.94‰ ± 0.08‰)，购于英国Elemental Microanalysis 公 司； USGS64 (甘氨酸，δ13CV-PDB＝－40.81‰ ± 0.04‰)、USGS40(δ15Nair＝－4.52‰ ± 0.06‰)、USGS54(加拿大松，δ2HV-SMOW＝－150.4‰ ± 1.1‰，δ18OV-SMOW＝17.79‰ ± 0.15‰)、USGS55(墨西哥木，δ2HV-SMOW＝－28.2‰ ± 1.7‰，δ18OV-SMOW＝19.12‰ ± 0.07‰)、USGS56(南非红象牙木，δ2HV-SMOW＝－44.0‰ ± 1.8‰，δ18OV-SMOW＝27.23‰± 0.03‰)，购于美国地质勘探局Reston 同位素实验室。

1.2 仪器与设备

Vario PYRO cube、Vario Isotope cube 型元素分析仪、Isoprime 100 型、Biovision 稳定同位素比率质谱仪，德国Elementar 公司；XP6 型天平，瑞士Mettler-Toledo公司；HR2864 粉碎机，飞利浦电子公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理 所有样品经粉碎机粉碎后过80目筛(孔径0.180 mm)，常温避光保存。

1.3.2 碳、氮元素及其稳定同位素检测 每个样品称取粉末3.0 ～ 4.0 mg 包样于锡箔杯中，经自动进样器进入元素分析仪。样品中的碳和氮元素经燃烧后分别转化为纯净的CO2和N2气体，进入同位素比率质谱仪进行检测。元素分析仪的燃烧管主要填料为WO3，温度1 150℃，还原管填料为Cu，温度850℃，载气为高纯氦气(纯度>99.999%)。

1.3.3 氢、氧稳定同位素检测 每个样品称取粉末0.8 ～ 1.2 mg 包样于银舟中，经自动进样器进入元素分析仪。样品中的氢元素和氧元素经高温裂解后分别转化为H2和CO，进入同位素比率质谱仪进行检测。元素分析仪裂解炉温度为1 450℃，氦气吹扫流量为150 mL·min－1。

1.3.4 稳定同位素比率计算 根据公式计算各稳定同位素比率[21]:

δE ＝(R样品－R标准)/R标准×1 000‰

式中，E 代表元素C、N、H、O；R样品为检测样品中重同位素与轻同位素丰度之比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O；R标准为国际标准品中重同位素与轻同位素丰度比。

1.4 数据处理

所有样品检测均重复2 次，取平均值作为该样品的元素含量及稳定同位素比率。不同产地样品间的δ15N 差异分析采用单因素方差分析中的Duncan 法进行比较，不同生产面积地区样品间的δ15N 差异分析采用非参数检验中的Kruskal Wallis 检验方法进行。通过正态分布模型模拟δ15N 分布情况，样品δ2H 和δ18O进行Pearson 相关性分析。数据处理均采用IBM SPSS Statistics 21(美国IBM 公司)软件。

2 结果与分析

2.1 我国有机茶稳定同位素特征

本研究对我国三分之二产茶省份的145 个有机茶样品开展了稳定同位素分布情况调查，包括江南、江北、华南和西南四大茶区，覆盖范围广，代表性强。由表2 可知，C 元素含量介于36.7% ～ 47.5%之间，平均值为42.2%，其中云南省样品平均值最低，陕西省最高，各产地间C 元素含量无显著差异。N 元素含量为1.8% ～ 6.2%，平均值为4.9%。河南省有机茶样品的N 元素含量最高，其次为陕西、江苏、安徽、四川和浙江，广东省有机茶样品N 元素含量最低，显著低于上述省份，南方省份样品N 元素含量普遍低于北方省份。C 和N 是植物体内两种重要的元素，含C 和N的化合物对茶树生长和茶叶品质均起着至关重要的作用。地理因素、气候因素、品种及栽培方式均会影响茶树的碳氮代谢平衡[22]。

表2 有机茶C、N 元素含量Table 2 Concentrations of C and N in organic tea samples /%

有机茶样品中稳定同位素比率见表3，不同产地的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 存在一定的区域差异。δ13C值介于－31.0‰ ～ －23.7‰之间，平均值为－26.6‰，湖南省有机茶样品的平均值最低，云南省最高，各产地间无显著差异。已有研究表明，δ13C 分布差异主要受植物光合作用的影响，包括温度、光照强度、CO2浓度等光合参数[23]。δ15N 值范围为－5.2‰ ～ 6.6‰，平均值为1.1‰，各省份有机茶样品的δ15N 标准偏差较大，不同产地间存在差异。其中江西省和贵州省有机茶样品δ15N 值最高，河南省样品δ15N 值最低。δ2H 值范围为－107.1‰ ～ －24.8‰，平均值为－49.4‰，其中陕西有机茶样品δ2H 值最高，福建样品最低，各省份有机茶样品δ2H 的标准偏差较大。δ18O值介于17.2‰ ～32.0‰之间，平均值为26.9‰，与δ2H 值在不同产地的分布规律相似，江苏省有机茶样品最高，福建最低。Pearson 相关性分析结果显示，δ2H 值与δ18O 值在0.01 水平上呈显著正相关(r＝0.74，P<0.01)。

2.2 有机茶δ15N 特征正态分布模型

δ15N 能够在一定程度上反映作物的栽培方式。已有研究表明施用有机肥料与化学肥料的大米、蔬菜等作物的δ15N 值差异明显[7－12]。δ15N 作为有机产品的重要指标需要开展进一步分析。本研究所涉及的145 个有机茶δ15N 频率直方图和正态分布曲线如图1-A 所示。在样品的频率分布中，41 个样品的δ15N<0，占全部样品的28%；74 个样品的δ15N 介于0 ～3.0‰之间，占比51%；30 个样品的δ15N > 3.0‰，占比21%。通过建立145 个样品的正态分布模型，模拟我国有机茶中δ15N 的分布情况。在正态分布模型中，有机茶的δ15N 平均值(μ)为1.2‰，中位数为1.1‰，标准偏差(σ)为2.3‰。95%的样品δ15N 分布在－3.2‰～ 5.6‰(μ ± 1.96σ)范围内，99%的样品δ15N 分布在－4.6‰ ～ 7.0‰(μ ± 2.58σ)范围内。

不同省份样品的δ15N 频率分布情况如图1-B 所示。结合各产地的δ15N 平均值，平均值最高的江西省有75%的样品δ15N > 3.0‰，在各省份中占比最大，所有样品的δ15N 均大于0。其次贵州有25%的样品δ15N> 3.0‰，δ15N 也全部大于0。福建和浙江δ15N >3.0‰的样品占比较大，分别为40%和34%。云南和广东的样品数量较少，其δ15N 均介于0 ～ 3.0‰之间。湖北和湖南的分布情况相似，60%的样品δ15N 介于0～ 3.0‰之间，δ15N > 3.0‰的样品分别占比16%和10%。δ15N 平均值较低的5 个省份陕西、四川、江苏、安徽和河南，δ15N<0 的样品分别占比33%、72%、75%、40%和67%，其中陕西、江苏、安徽和河南没有样品δ15N 大于3.0‰。

2.3 有机茶δ15N 特征与生产面积相关性

各产地有机茶δ15N 分布差异与茶树是否处于转换期密切相关。国家农业行业标准《NY/T 5197－2002有机茶生产技术规程》[24]规定，常规茶园成为有机茶园一般需要经过3年的转换期，生产者在转换期间必须完全按有机茶生产技术规程的要求进行管理，但品质特征可能受到前期肥料、栽培等因素的影响。2018年全国已渡过转换期的有机茶产量为11.6 万吨，转换期产品产量为7.7 万吨(图2-A)，说明我国有机茶中有近40%属于转换期产品。目前我国共有21 个省份生产有机茶，图2-B 为2016年至2018年我国有机茶生产面积连续排名前九位的省份[1]。连续3年生产面积大的省份，表明已渡过转换期的有机茶产量多，而生产面积小的省份，推测部分产品尚处于转换期。将本研究所涉及的省份按照生产面积进行合并与分组，云南、江西和贵州为生产面积大的地区，江苏、河南和陕西为生产面积小的地区，两组均为10 个样品。对两组样品进行δ15N 值比对，结果如图3-A 所示。两组样品的δ15N 分布较为集中，分别分布于1.6‰ ～ 5.8‰和－2.5‰ ～ 0.4‰之间，平均值分别为3.2‰和－0.6‰。采用非参数检验对两组样品进行比较，生产面积大的地区样品δ15N 显著高于生产面积小的地区样品(P<0.01)。将两组样品的δ15N 值分别建立正态分布曲线，结果见图3-B。生产面积大的地区95%的样品δ15N 分布范围是0.5‰ ～ 5.9‰，生产面积小的地区95%的样品δ15N 分布范围为－2.6‰ ～ 1.4‰。两组样品在0.5‰ ～ 1.4‰之间有部分重合。

3 讨论

目前关于有机茶稳定同位素的相关研究较少，建立覆盖面广、稳定性强的数据库是利用稳定同位素开展有机茶鉴别的基础。本研究广泛调查了我国有机茶中稳定同位素δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 范围和分布情况。其中δ13C 值介于－31.0‰ ～ －23.7‰，与已有研究中不同产地的常规茶叶δ13C 范围较为一致(－28.02‰～ －23.61‰)[25]。δ2H 和δ18O 范围分别为－107.1‰ ～ －24.8‰和17.2‰ ～ 32.0‰，平均值分别为－49.4‰和26.9‰，不同地域间差异较大，但平均值和地域分布规律与已报道的常规茶叶中稳定同位素结果基本一致[23，26－27]，推测δ2H 和δ18O 受施肥种类影响较小。已有研究表明，δ2H 和δ18O 均与纬度、海拔、降水、离海岸距离等因素相关[18－19]。本研究有效扩充了我国有机茶稳定同位素数据库，探明了有机茶同位素特征分布情况及地域差异，为有机茶的鉴别研究奠定了一定的理论基础。

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δ15N 是区别有机产品的重要指标。已有研究表明，通常有机果蔬的δ15N 值大于5.0‰，有机大米的δ15N 值大于3.0‰[28]。中野明正等[13]测得日本有机茶中δ15N 值为6.8‰，试验样品已连续20年进行有机栽培。冯海强等[29]根据质量平衡原理推算得出有机茶中δ15N 值应高于7‰。本研究测得我国有机茶中δ15N 值范围为－5.2‰ ～ 6.6‰，有51%的样品δ15N 值介于0 ～ 3.0‰，较其他研究中有机产品δ15N 值明显偏低，推测与我国40%的有机茶尚处于转换期有关。现有研究认为，转换期作物δ15N 值通常低于普通有机作物。如有机大米中δ15N 值为4.9‰ ～ 5.3‰，转换期大米δ15N 值为3.5‰ ～ 4.6‰，常规栽培大米δ15N值为2.8‰ ～ 3.3‰[28]。Nobuyuki 等[14]研究发现有机栽培与普通栽培的茶叶在试验初期δ15N 值差异不大，而连续5年有机栽培的茶叶δ15N 值明显增加。同时，本研究结果表明有机茶生产面积大的地区样品δ15N 值显著高于生产面积小的地区样品，推测是由于生产面积大的省份有更多的有机茶产品已渡过转换期。其中云南和贵州气候环境适宜，绿肥资源和茶树良种资源丰富，适合发展有机茶产业。近年来两省茶产业规模扩张迅速，尤其重视高优生态茶园建设和管理，有机茶产业发展迅速[30]。同时，我国有机茶园多使用饼肥作为有机肥料，如菜籽饼、茶籽饼、大豆饼等[31]，此类植物源有机肥δ15N 值通常低于动物源堆肥，这也可能是导致我国有机茶中δ15N 值偏低的原因之一。在已有报道中，我国部分产区的常规茶叶δ15N 值大多分布于3.0‰左右[23，25－27]，与本研究有机茶样品中δ15N值无较大差异。推测是由于我国常规种植的茶叶存在化肥和有机肥混合使用的现象，并非完全使用化肥，使得常规茶的δ15N 值接近于有机茶。除了栽培管理因素，引起作物中δ15N差异的原因还包括土壤类型、前期土地利用、植物根系生长情况等因素[32]。此外，市场上有机茶中出现有机标识假冒和误标的情况也难以避免，影响到研究样品信息的真实性。目前我国有机茶种植范围广，各地茶园环境和管理能力差异较大，尚有大量有机茶处于转换阶段。因此，单纯以δ15N 作为有机茶鉴别标准不够科学和完善，需要挖掘更多能够反映有机茶特征的指标，同时结合化学计量学等方法开展有机茶鉴别研究。

4 结论

本研究结果表明，目前我国有机茶中δ13C、δ2H 和δ18O 与已有研究中常规茶表现基本一致，分别分布于－31.0‰ ～ －23.7‰、－107.1‰ ～ －24.8‰和17.2‰～ 32.0‰。相较于其他同位素，δ15N 作为有机农产品标识指标之一，其正态分布范围是－4.6‰ ～ 7.0‰，表现为生产面积大的地区显著高于生产面积小的地区。因此δ15N 具有成为有机茶鉴别重要指标的潜力，但需要进一步扩大样品收集范围，涵盖更多地域及生长阶段的样品。同时，稳定同位素溯源技术有待与其他鉴别技术相结合，完善信息追溯体系，利用多维信息融合技术更好地应用于有机茶的真伪鉴别。