沙利度胺对四氯化碳致小鼠肝纤维化的影响

王彩娥，杨鹿奎，李桂芳，曹永建，高文芳

(河南科技大学第一附属医院药学部，河南科技大学临床医学院，河南 洛阳 471003)

沙利度胺为谷氨酸衍生物，具有镇静止痛、免疫调节、抗炎、抑制血管生成及抗肿瘤等多种药理作用[1-4]，临床上广泛应用于麻风结节性红斑和多发性骨髓瘤的治疗。肝纤维化是由多种致病因子导致的肝细胞外基质弥漫性过度沉积与异常分布，其发生、发展过程中有多种细胞及介质参与，常可发展为肝硬化，进而衍变为肝癌，最终导致患者死亡[5-6]，抗肝纤维化治疗可终止或逆转肝脏病变。研究显示，免疫调节与肝纤维化发生、发展密切相关[7]，而沙利度胺具有免疫调节及抗炎作用，故推测沙利度胺可能具有抗纤维化作用。基于此，本研究通过探讨沙利度胺对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化模型小鼠的影响及可能机制，旨在为沙利度胺应用于肝纤维化的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物C57BL/6雄性小鼠24只，体质量(25±3)g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2017-0001，合格证书号：DW2020090026。饲养于河南科技大学第一附属医院动物房，标准饲料，自由饮水，室温18～25 ℃、相对湿度40%～70%、12 h光照昼夜循环适应性饲养1周后开始实验。

1.2 试剂与仪器CCl4购自天津市富宇精细化工有限公司[合格证编号(津)XK 13-011-00034]，沙利度胺片购自常州制药有限公司(生产批号18070331，研钵捣碎后加入生理盐水，制成3.0 g·L-1的混悬液备用，每次灌胃前充分摇匀)，复方甘草酸苷片购自北京凯因科技股份有限公司(生产批号200303，研钵捣碎后加入生理盐水，制成 3.5 g·L-1的混悬液备用，每次灌胃前充分摇匀)，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)、Masson及免疫荧光双染色试剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫试剂盒购自赛默飞生物有限公司，M1巨噬细胞表面标志物CD68、M2巨噬细胞表面标志物CD163抗体、荧光标记的免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗以及小牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；GZX-DH-40×45 型倒置显微镜购自德国 Leica 公司，荧光显微镜购自日本 OLYMPUS 公司，全波长酶标仪购自美国Thermo Fisher公司，全自动生物化学分析仪购自日本日立高新公司，台式常温离心机购自德国Eppendorf公司，-80 ℃超低温冰箱购自日本Panasonic公司，AL104型电子分析天平购自瑞士梅特勒-托利公司，FA2004B电子天平购自上海精科天美科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型制备将24只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、复方甘草酸苷片组(阳性对照组)、沙利度胺组，每组6只。正常组小鼠分别于每周一和周四腹腔注射橄榄油10 μL·g-1，连续6周；模型组、阳性对照组、沙利度胺组小鼠分别于每周一和周四腹腔注射体积分数0.6 % CCl4(10 μL·g-1)，连续6周。造模第5周开始，阳性对照组小鼠给予3.5 g·L-1复方甘草酸苷片混悬液灌胃(阳性对照组小鼠灌胃复方甘草酸苷片剂量为 35 mg·kg-1·d-1，根据人鼠体表面积等效剂量比值，按成人每日临床剂量3.75 mg·kg-1换算)；沙利度胺组小鼠给予3.0 g·L-1沙利度胺混悬液灌胃(沙利度胺给药剂量为30 mg·kg-1·d-1，剂量根据前期预实验中沙利度胺对CCl4诱导急性小鼠肝损伤的作用结果确定)；正常组和模型组给予生理盐水灌胃，灌胃体积均为10 μL·g-1。各组小鼠均于每日下午15：00～17：00灌胃1次，连续2周。

1.3.2 小鼠体质量分析使用FA2004B电子天平称量小鼠体质量，小鼠体质量以实验开始第1天作为第0周，固定于每周一下午15：00～17：00称量1次至实验结束，称量前禁食6 h，实验结束后汇总分析各组小鼠的体质量变化。

1.3.3 肝组织标本收集第6周末次给药2 h后，利用直径0.5 mm毛细管眼眶取血约0.6 mL，全血室温下静置2 h，低温2 000×g离心15 min，收集上层血清分装于冻存管中存放于-80 ℃冰箱中备用。取血后的小鼠吸入过量七氟烷麻醉致死，冰上分离肝组织，生理盐水冲洗干净后，拭干，称量，计算小鼠肝指数(肝指数=肝质量/体质量×100%)；然后分离肝组织，将一部分肝组织用体积分数10%中性甲醛溶液固定，用于肝组织病理学检查；另一部分装于冻存管存放于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.4 HE染色观察小鼠肝细胞状态肝组织经体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h 后，常规脱水，石蜡包埋，切片；40 ℃温水将切片组织展平，60 ℃烘箱内烤片，烤干后至常温；苏木精染色5 min，自来水冲洗，分化液分化30 s后再用自来水浸泡15 min；伊红染色5 s，自来水冲洗，蒸馏水浸泡2 min，体积分数95%乙醇脱水至透明；中性树胶封固，采用GZX-DH-40×45型倒置显微镜观察肝细胞结构和排列状态。

1.3.5 Masson染色观察小鼠肝组织结构肝组织经体积分数10%中性甲醛溶液固定24 h后，常规脱水，石蜡包埋，切片；40 ℃温水将切片组织展平，载玻片将组织捞起后60 ℃烘箱内烤片，烤干后至常温；切片浸入Masson A液中浸泡过夜，自来水冲洗，浸入Masson B液及Masson C液等比混合的染液，浸染1 min，自来水冲洗，体积分数1%盐酸乙醇分化，自来水冲洗，浸入Masson D液浸染6 min，自来水漂洗后浸入Masson E液浸染1 min，稍沥干直接入Masson F液染30 s，体积分数1%冰醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水至透明；中性树胶封片，GZX-DH-40×45型倒置显微镜观察肝组织汇管区和肝小叶中有无明显胶原纤维增生和桥接形成，每组选取3个切片，每张切片随机选择3个不同视野，采用半定量标准对Masson染色胶原纤维增生程度进行评分，取3个不同视野平均评分作为该切片评分。Masson染色评分：正常为0分；汇管区、小叶中央静脉周围胶原增加为1分；汇管区、小叶中央静脉周围胶原进一步增加，胶原开始穿插、分隔肝小叶为2分；胶原纤维较细、包绕分隔肝小叶为3分；胶原纤维变宽、增多为4分。

1.3.6 全自动生物化学分析仪速率法检测小鼠血清丙氨酸转移酶(alanine amino-transferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)水平取-80 ℃保存的各组小鼠血清，自然融化后，使用全自动生物化学分析仪，采用速率法检测血清ALT、AST水平。

1.3.7 酶联免疫吸附试验法检测小鼠肝组织中TNF-α水平检测准确称取50 mg小鼠肝组织，按照质量(mg)体积(μL)=19的比例加入9倍体积生理盐水，冰水浴条件下制备成100 g·L-1的肝组织匀浆液，2 000×g离心10 min，取上清液，使用Thermal Fisher全波长酶标仪，采用在450 nm波长下检测肝组织中TNF-α水平，严格按TNF-α 酶联免疫检测试剂盒说明书操作。

1.3.8 免疫荧光法检测小鼠肝组织中CD68和CD163表达采用石蜡切片免疫荧光双标检测CD68和CD163的表达。将各组小鼠的肝组织经体积分数 10% 中性甲醛溶液固定24 h 后，常规脱水，石蜡包埋，切片；40 ℃温水将切片组织展平，载玻片将组织捞起后60 ℃烘箱内烤片，烤干后至常温；乙二胺四乙酸缓冲液(pH 8.0)对切片进行抗原修复，然后用体积分数3%双氧水溶液避光孵育25 min，封闭内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solation，PBS)脱色，洗涤，漂洗；切片稍甩干，滴加体积分数3% BSA，封闭 30 min，甩掉封闭液，加入CD68一抗，4 ℃孵育过夜，滴加花青素3(cyanidin 3，CY3)标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育50 min，Tris缓冲液(Tris buffered saline Tween，TBST)冲洗3次，每次 5 min，避光室温孵育10 min，置于TBST中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min，微波处理，中火8 min，停火8 min，转低火7 min；再加CD163一抗，4 ℃孵育过夜，滴加异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔IgG二抗覆盖组织，避光室温孵育50 min；6-二脒基-2-苯基吲哚(6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染细胞核，室温避光孵育10 min，自发荧光淬灭，PBS洗涤3次，每次 5 min。甩干加入自发荧光淬灭剂5 min，洗涤10 min，封片，在荧光显微镜下观察拍照，红光荧光为CD68阳性表达，绿光荧光为CD163阳性表达。

2 结果

2.1 4组小鼠体质量比较结果见表1。第0、1、2、3、4、5、6周，各组小鼠之间体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 4组小鼠体质量比较

2.2 4组小鼠肝质量及肝指数比较结果见表2。第6周末，模型组小鼠肝质量及肝指数均显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝质量及肝指数均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。沙利度胺组与阳性对照组小鼠肝质量及肝指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 4组小鼠肝质量及肝指数比较

2.3 4组小鼠血清 AST、ALT水平及肝组织TNF-α水平比较结果见表3。模型组、阳性对照组及沙利度胺组小鼠血清ALT、AST水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组及沙利度胺组小鼠血清ALT、AST水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；沙利度胺组与阳性对照组小鼠血清ALT、AST水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组小鼠肝组织中TNF-α水平显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组及沙利度胺组与正常组小鼠肝组织中TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；阳性对照组及沙利度胺组小鼠肝组织中TNF-α水平显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；沙利度胺组与阳性对照组小鼠肝组织中TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 4组小鼠血清 ALT、AST水平及肝组织TNF-α水平比较

2.4 4组小鼠肝组织病理学变化HE染色显示，正常组小鼠肝细胞结构完整，排列规则，肝小叶结构清晰(图1A)；模型组小鼠肝组织汇管区与门静脉周围肝细胞大量空泡样坏死，排列紊乱，肝小叶结构不完整(图1B)；阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织汇管区与门静脉周围有少量空泡样坏死，肝细胞排列基本规则(图1C和图1D)。 Masson染色显示，正常组小鼠中肝组织无明显胶原纤维增生(图2A)；模型组肝汇管区门静脉与中央静脉周围大量胶原纤维增生，且有少量桥接形成(图2B)；阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织局部的汇管区和中央静脉周围有少量胶原纤维增生(图2C和图2D)。正常组、模型组、阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织Masson评分分别为(0.00±0.00)、(2.67±0.58)、(1.00±0.00)、(0.67±0.58)分；模型组小鼠肝组织Masson评分显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织Masson评分显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组与沙利度胺组小鼠肝组织Masson评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A： 正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：沙利度胺组。

A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：沙利度胺组。

2.5 4组小鼠肝组织中CD68和CD163的表达结果见图3。正常组小鼠肝组织中存在少量CD68和CD163荧光阳性表达(图3A2和图3A3)；与正常组比较，模型组小鼠肝组织中CD68阳性表达相对增强(图3B2)， CD163阳性表达相对减弱(图3B3)。与模型组比，沙利度胺组CD68阳性表达相对较弱(图3D2)，CD163阳性表达相对较强(图3D3)。与阳性对照组相比，沙利度胺组CD68阳性表达相似，但CD163阳性表达较强。

A1、A2、A3、A4：正常组；B1、B2、B3、B4：模型组；C1、C2、C3、C4：阳性对照组；D1、D2、D3、D4：沙利度胺组。DAPI：代表细胞核显色；Merge：代表同一视野下不同波长荧光激发下细胞核显色、CD68阳性表达和CD163阳性表达三者融合图。

3 讨论

肝病在我国为常见病和多发病，主要包括乙型肝炎、丙型肝炎、酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病。肝纤维化是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段，然而目前临床尚无有效的抗肝纤维化药物。肝纤维化是多种因素引起的慢性肝脏疾病损伤修复的病理过程，是严重的公共卫生问题[8]。肝纤维化的发生机制复杂，其可能与免疫调节失衡有关。巨噬细胞作为机体固有免疫细胞的重要组成部分，参与肝脏的损伤及修复，在肝纤维化形成和逆转中发挥重要作用[9]。沙利度胺作为一种潜在的免疫调节剂，其是否对肝纤维化的发生、发展具有改善作用尚不明确。复方甘草酸苷属于甘草酸类，具有抗炎、免疫调节及抗肝纤维化等作用[10]，临床主要用于治疗慢性肝病，改善肝损伤。本研究以复方甘草酸苷为对照，观察沙利度胺对肝纤维化模型小鼠的影响，旨在为沙利度胺应用于肝纤维化的临床治疗提供参考。

本研究中肝组织病理学观察结果显示，正常组小鼠肝细胞结构完整，排列规则，肝小叶结构清晰，肝组织无明显胶原纤维增生；而模型组小鼠肝组织汇管区与门静脉周围肝细胞大量空泡样坏死，排列紊乱，肝小叶结构不完整，汇管区门静脉与中央静脉周围大量胶原纤维增生，且有少量桥接形成，表明模型组小鼠出现了肝纤维化的症状，小鼠肝纤维化模型建立成功；阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织汇管区与门静脉周围肝细胞有少量空泡样坏死，局部汇管区和中央静脉周围有少量胶原纤维增生，肝细胞排列基本规则，提示复方甘草酸苷和沙利度胺均可改善小鼠肝损伤程度，延缓小鼠肝纤维化的进程。

AST和ALT为反映肝细胞损伤的重要生物化学指标，肝损伤时，肝细胞中AST和ALT被释放到血液中，通常表现为血液中AST和ALT水平急剧升高[11]。陈江明等[12]研究发现，沙利度胺能够改善地中海贫血导致的肝损伤。本研究结果显示，与正常组相比较，模型组、阳性对照组及沙利度胺组小鼠血清ALT、AST升高，表明小鼠已发生显著的肝损伤；而与模型组比较，阳性对照组及沙利度胺组小鼠血清ALT、AST水平显著降低，表明给予复方甘草酸苷和沙利度胺均可减轻小鼠肝损伤程度；沙利度胺组小鼠血清ALT、AST水平与阳性对照组比较差异无统计学意义，提示沙利度胺与复方甘草酸苷改善肝纤维化小鼠肝损伤的效果相当。

炎症反应在肝纤维化中起着至关重要的作用。研究发现，肝脏库普弗细胞在肝损伤期间会募集中性粒细胞和T淋巴细胞，并释放促炎因子如TNF-α等，同时刺激肝星状细胞的纤维化活性[13]；李德忠等[14]研究发现，肝纤维化患者肝Ⅳ型胶原-C水平与TNF-α水平呈正相关；冼观秀等[15]也发现，乙肝肝硬化患者血清中TNF-α水平与肝纤维化指标Ⅳ型胶原-C呈正相关；因此，TNF-α等促炎因子作为肝纤维化指标具有较高的价值。本研究结果显示，与正常组相比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α水平显著升高；与模型组比较，阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织TNF-α水平显著降低，且沙利度胺组小鼠肝组织TNF-α水平与阳性对照组比较差异无统计学意义；本研究结果表明，沙利度胺与复方甘草酸苷均能够显著降低肝组织中TNF-α水平，二者抗小鼠肝纤维化的作用效果相当。

免疫调节中巨噬细胞过度极化引起的促炎因子释放和组织修复能力紊乱是导致肝纤维化的重要因素[16-17]，恰当干预巨噬细胞极化方向有助于延缓肝内炎症及纤维化的发生、发展[18-19]。巨噬细胞可极化为2种类型，即经典活化的M1型和选择性活化的M2型。M1型主要介导促炎作用，可分泌大量的TNF-α，促进肝纤维化进展；M2型主要分泌抑炎因子，表达组织修复相关因子等功能，发挥抗肝纤维化作用[20-21]，因此，M1型和M2型可作为探究肝纤维化发生、发展机制的相关因子。研究表明，CD68和CD163可分别作为M1型和M2型巨噬细胞表面标志物[22-23]，CD68是一种细胞质糖蛋白，是巨噬细胞最可靠的标志物；CD163是一种Ⅰ型膜蛋白，几乎表达于所有组织的单核巨噬细胞。麦维利等[18]研究发现，在急性肝损伤中抑制M1型巨噬细胞极化能够发挥抗炎作用；GUO等[19]研究发现，限制巨噬细胞向M2型极化可促进二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化的发生；许大勇等[24]报道，调控巨噬细胞向M2型极化能够抑制脊髓损伤造成的炎症反应。因此，本研究分别以M1型巨噬细胞的标志物CD68和M2型巨噬细胞的标志物CD163阳性表达强度来评估M1和M2型巨噬细胞的极化程度，通过免疫荧光双染色在同一视野下观察CD68和CD163阳性表达强度，进而探究沙利度胺抗肝纤维化的可能机制。本研究结果显示，正常组小鼠肝组织中存在CD68和CD163阳性表达；相对于正常组小鼠，模型组小鼠肝组织中CD68呈强阳性表达，CD163阳性表达则较弱，表明模型组中巨噬细胞向M1型极化程度相对增多，向M2型极化程度相对减少；与模型组比较，沙利度胺组小鼠肝组织CD68阳性表达相对较弱，CD163阳性表达相对较强，表明沙利度胺干预后巨噬细胞向M1型极化程度相对降低，向M2型极化程度相对增多；阳性对照组和沙利度胺组小鼠肝组织中CD163和CD68阳性表达趋势不一致，可能原因是二者对巨噬细胞的影响机制不一致，提示沙利度胺抗肝纤维化的机制可能是沙利度胺能够促进巨噬细胞向M2型方向极化且抑制向M1型方向极化，这与文献报道的抗肝纤维化机制一致[18-19，23]。本研究对CD68和CD163蛋白表达只进行了定性分析，而对其定量分析以及沙利度胺是否通过经典通路调控巨噬细胞的表型和功能改变从而抑制肝纤维化、改善肝损伤，还有待后续深入探究。

综上所述，沙利度胺可有效改善CCl4诱导的小鼠肝纤维化，显著改善小鼠的肝损伤，其作用机制可能与影响巨噬细胞极化有关。