盐酸多奈哌齐对骨关节炎大鼠软骨组织中肿瘤坏死因子-α和解整链蛋白金属蛋白酶-5表达的影响

李 刚，籍胤玺，侯晓东

(1.南阳市中心医院骨科,河南 南阳 473000;2.河南大学第一附属医院骨科,河南 开封 475000)

膝骨关节炎是因膝关节软骨的退行性变致使软骨及关节周围肌肉损害进而引起的进展性关节疾病[1]。其发病机制为关节内部的软骨组织出现病变，导致关节软骨局部结构性破坏及病变[2]。该病发生的生物力学因素是覆盖在关节表面的关节软骨退变，其病理过程分为软骨组织内出现蛋白降解、软骨纤维化、滑膜炎3个阶段[3]。膝骨关节炎的主要病理特点是滑膜增生[4]，其临床症状主要表现为关节疼痛、功能障碍、活动能力减低，伴有关节畸形等，严重影响患者日常活动及生存质量[5-6]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子主要由T 细胞等免疫细胞产生，参与骨关节炎的发生与发展。TNF-α可影响软骨细胞的代谢，有研究发现，炎症反应与膝骨关节炎的发生有关[7]。含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶与膝骨关节炎的发展密切相关，带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5,ADAMTS-5)可使软骨中蛋白聚糖发生变性，从而出现降解[8]。盐酸多奈哌齐可增加血管性痴呆大鼠脑组织中乙酰胆碱的水平，而乙酰胆碱具有抑制免疫细胞释放大量炎症因子的作用[9]。基于此，本研究通过建立骨关节炎大鼠模型来探讨盐酸多奈哌齐对骨关节炎软骨组织中TNF-α和ADAMTS-5的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物无特定病原体级Sprague Dawley雌性大鼠30只，体质量(200±17)g，购自上海基尔顿生物有限公司。

1.2 试剂与仪器盐酸多奈哌齐购自卫材(中国)药业有限公司(国药准字H20050978)，金属基质蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3，MMP-3)抗体购自美国Abcam公司，TNF-α抗体购自上海沪峥生物公司，ADAMTS-5抗体购自上海士峰生物科技有限公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE) 染色试剂购自上海信帆生物科技有限公司，多聚甲醛购自济南创世化工有限公司；伯乐电泳仪购自北京伯乐生命科学发展有限公司，VT1200S振动切片机购自德国 Leica公司，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪购自美国Applied Biosystems公司，DYY-6C电泳仪购自北京六一仪器厂，BX41显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 模型制备与分组将大鼠随机分为正常组、模型组和盐酸多奈哌齐组，每组10只。模型组和盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节腔注射40 g·L-1木瓜蛋白酶 0.15 mL制备膝骨关节炎模型，3 d注射1次，共注射3次；正常组大鼠注射等体积的生理盐水。造模后进行组织病理学检查，胫骨远端骨小梁吸收破坏，累及骨皮质，关节软骨可见坏死性脱落、纤维化、关节腔狭窄为造模成功。造模成功后第7天，盐酸多奈哌齐组大鼠给予盐酸多奈哌齐(3 mL·kg-1)灌胃，每日1次；正常组和模型组大鼠给予相同剂量的生理盐水灌胃；均持续灌胃6周。

1.4 大鼠关节炎症程度评估3组大鼠分别于灌胃1、3、6周时采用关节炎指数评分评估大鼠关节炎症程度。0分：关节无明显炎症；1分：小趾关节有轻微炎症；2分：趾关节和足趾关节有明显炎症；3分：踝关节以下的足爪关节有明显炎症；4分：踝关节在内的全部足爪关节有明显炎症。

1.5 HE染色观察大鼠膝关节结构改变情况灌胃结束时麻醉处死大鼠，取膝关节，甲醛溶液固定膝关节组织，乙醇脱水，石蜡包埋后切片(厚4 μm)，山羊血清封闭，苏木精染色6～8 s，伊红染色液复染10 s。于显微镜下观察大鼠膝关节结构改变情况。

1.6 反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测大鼠软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA表达取各组大鼠膝关节软骨组织，加入1.25 g·L-1胰蛋白酶消化 4 h,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)冲洗,滴入9 g·L-1氯化钠溶液，TRIzol法提取总RNA，将总RNA反转录为 cDNA。TNF-α上游引物序列为5′-CTGGGCAGCGTTTATTCT-3′，下游引物序列为5′-TTGCTTCTTCCCTGTTCC-3′；ADAMTS-5上游引物序列为5′-CTTGACCTTCGGCCTGA-3，下游引物序列为5′-CACTGTTTGTGGGTGCAG-3′；内参β-action上游引物序列为5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列为5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′。应用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对TNF-α、ADAMTS-5 mRNA表达水平进行检测。反应条件：98 ℃ 6 min，98 ℃ 28 s，75 ℃ 30 s，80 ℃ 4 min，共55个循环。实验重复3次，取均值。采用2-ΔΔCt法计算TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相对表达量。

1.7 Western blot法检测大鼠软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5蛋白表达将软骨组织置于装有细胞裂解液玻璃匀浆器中裂解30 min，超声破碎 (10 s，3次) 后4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，取上清液用生物活性炭法检测蛋白浓度，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(每孔加样20 μg蛋白)，转膜,加入50 g·L-1脱脂奶粉，然后加入0.01 mol·L-1PBS冲洗，室温封闭1 h 后，TBST 洗膜，加入ADAMTS-5、TNF-α一抗(11 000)，4 ℃过夜;TBST洗膜，分别加入对应二抗(11 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜，增强化学发光法显色。应用Image J软件分析ADAMTS-5、TNF-α及磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehgde phosphate dehydrogenase,GAPDH)灰度值。以目的蛋白灰度值与β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。实验重复10次，取均值。

1.8 免疫组织化学法检测软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 阳性表达大鼠软骨组织于体积分数10%中性甲醛缓冲液中固定24 h后，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋，完成蜡块制备。组织蜡块经修片、切片、展片、烤片，完成石蜡切片制作。石蜡切片进行免疫组织化学染色，滴加一抗，37 ℃静置2 h或4 ℃过夜；一抗稀释比例TNF-a(150)，ADAMTS-5(1100)，滴加二抗辣根过氧化物酶标记的抗鼠/兔的二抗和3,3′-二氨基联苯胺显色液，PBS洗3次,每次2 min；室温下显色10 min，显微镜下观察染色程度，自来水冲洗10 min，脱水、透明、封片。在光学显微镜下观察TNF-α和ADAMTS-5阳性表达结果，并计算TNF-α阳性细胞数与ADAMTS-5阳性细胞数。细胞质被染成棕褐色为阳性细胞。每张切片随机选取5个视野，200倍光学显微镜下进行阳性细胞计数，取平均数。

2 结果

2.1 3组大鼠关节炎指数评分比较结果见表1，灌胃1、3、6周时，模型组和盐酸多奈哌齐组大鼠关节炎指数评分均显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组大鼠关节炎指数评分显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 3组大鼠关节炎指数评分比较

2.2 3组大鼠膝关节结构改变情况结果见图1。正常组大鼠未见滑膜组织炎症细胞浸润，未发现滑膜纤维增生现象；模型组大鼠关节组织内大量炎症细胞浸润，关节囊可见囊性炎症增生，囊内韧带神经损伤，滑膜和纤维组织增生；盐酸多奈哌齐组大鼠滑膜组织炎症细胞浸润减少，纤维增生改善。

A：正常组；B：模型组；C：盐酸多奈哌齐组。

2.3 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相对表达量比较结果见表2。模型组和盐酸多奈哌齐组膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相对表达量显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相对表达量均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 mRNA相对表达量比较

2.4 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相对表达量比较结果见图2和表3。模型组和盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相对表达量均显著高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相对表达量均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白表达

表3 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5 蛋白相对表达量比较

2.5 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数比较结果见图3和表4。模型组和盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数均高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5表达(免疫组织化学染色，×200)

表4 3组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数比较

3 讨论

膝骨关节炎是一种关节退行性病变，多数患者青年时期就患有该病，但常无明显症状，随着年龄的增长,膝关节软骨的退变进行性加重，进而出现临床症状，严重影响患者的生活质量[9-11]。大鼠膝骨关节受到损伤时软骨周围血管内的血液循环出现阻碍，膝骨关节液的吸收和释放能力紊乱，软骨组织内营养供给不足，有害物质聚集无法排出，导致软骨细胞损伤及基质异常[12]。本研究结果显示，模型组大鼠膝关节软骨组织内被大量炎症细胞浸润，关节囊可见囊性炎症增生，滑膜和纤维组织增生，盐酸多奈哌齐组大鼠滑膜组织的病理改变较模型组轻，正常组大鼠未见滑膜组织炎症细胞浸润、未发现滑膜纤维增生现象；证实盐酸多奈哌齐能够显著改善膝关节炎症浸润和纤维增生。有研究发现，盐酸多奈哌齐可对炎症细胞产生调控作用，提高机体免疫力，改善关节炎症[13-14]。相关研究表明，盐酸多奈哌齐治疗大鼠骨关节炎疗效较好，其作用机制可能与抑制炎症反应和软骨细胞凋亡有关[15]。刘艳伟等[13]研究发现，在骨关节炎大鼠关节软骨中TNF-α表达水平高于正常组大鼠，提示TNF-α在软骨退变和骨关节炎症中起重要作用，可促进骨关节炎发生发展。

本研究发现，模型组和盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相对表达量均高于正常组，盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5蛋白相对表达量低于模型组。与正常组相比，模型组大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数均高于正常组，盐酸多奈哌齐组大鼠膝关节软组织中TNF-α、ADAMTS-5阳性细胞数低于模型组。有文献报道，ADAMTS-5参与调控多种组织、细胞、器官的生长发育，在软骨增生过程中发挥重要作用，ADAMTS-5可破坏关节血管的生成，在膝骨关节炎疾病的发生发展中起到重要作用[16]。TNF-α是骨关节炎的重要炎症物质，诱导软骨细胞出现氧化反应，可与ADAMTS-5共同作用促进骨细胞的吸收[17]。TNF-α参与机体内多种细胞的增殖、凋亡过程，在正常生物体内TNF-α呈低表达，在患病生物体内TNF-α呈高表达[18]。本研究中，给予盐酸多奈哌齐干预后，大鼠膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5表达水平随之下降，提示盐酸多奈哌齐可能通过降低大鼠关节组织中TNF-α、ADAMTS-5表达而改善病情,与张大伟[19]研究结果一致。

综上所述，盐酸多奈哌齐可通过抑制膝关节软骨组织中TNF-α、ADAMTS-5表达对骨关节炎大鼠软骨起到保护作用。