Toll样受体3和Toll样受体4在原发性IgA肾病患儿肾组织中的表达及意义

朱小娟，韩玫瑰，张芳敏，黄 倩，赵德安，王凌超，韩子明

(新乡医学院第一附属医院儿科，河南 卫辉 453100)

原发性IgA肾病是以血尿为主要临床表现的最常见的原发性肾小球疾病之一，其典型的病理表现为光镜下系膜细胞增生和基质增多，以局灶节段性系膜增生最为常见，少数呈弥漫性增生性肾小球肾炎伴灶性新月体形成，免疫荧光检查显示肾小球系膜区IgA沉积或以IgA为主的免疫球蛋白沉积，电镜检查显示不同程度的系膜细胞和基质增生致系膜区扩大、系膜区或系膜旁区电子致密物沉积。原发性IgA肾病临床表现形式多样，呈慢性进展，部分患儿进展至终末期肾脏病[1]。近年来研究发现，Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)参与IgA肾病的发生与发展[2]，TLR3、TLR4在IgA肾病患儿肾组织及外周血单个核细胞中表达上调[3]。贾妮旦等[4]研究显示，TLR1、TLR3和TLR9 mRNA在原发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞中表达显著增高，且与病情活动有相关性。张芳敏等[5]研究显示，TLR4和TLR7在原发性肾病综合征患者肾组织中表达升高，且其表达与病理类型有关。本研究旨在探讨原发性IgA肾病患儿肾组织中TLR3、TLR4的表达及其与病理类型的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2014年7月至2019年6月新乡医学院第一附属医院儿内科收治的原发性IgA肾病患儿为研究对象。病例纳入标准：(1)符合原发性IgA肾病诊断标准[1]，并在超声引导下行肾穿刺术获得肾组织经病理学检查确诊；(2)年龄<18岁；(3)处于疾病活动期；(4)未使用过糖皮质激素等免疫抑制剂；(5)病历资料完整。排除标准：(1)合并遗传性肾病或家族性肾病等；(2)合并其他严重疾病。本研究共纳入原发性IgA肾病64例，根据牛津分类法[6-7]将患儿分为M0组和M1组。M0组10例，男7例，女3例；年龄2.9～16.0(9.23±4.48)岁；镜下血尿3例，肉眼血尿7例；尿蛋白水平：阴性2例，<25 mg·kg-13例，25～50 mg·kg-12例，>50 mg·kg-13例。M1组54例，男41例，女13例；年龄3.2～17.0(9.45±3.17)岁；镜下血尿21例，肉眼血尿33 例；尿蛋白水平：阴性5例，<25 mg·kg-110例， 25～50 mg·kg-17例，>50 mg·kg-132例。2组患儿的性别、年龄、血尿情况及尿蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。另选择同期于新乡医学院第一附属医院儿外科行肾脏切除的7例肾肿瘤患儿作为对照组(取距离肿瘤组织2 cm以上的正常组织的肾皮质)，男6例，女1例；年龄1.2～14.0(6.66±5.00)岁。3组患儿的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究通过医院医学伦理委员会批准，所有受试者家属签订知情同意书。

1.2 试剂与仪器柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)、二氨基联苯胺购自福州迈新生物技术开发有限公司，Anti-TLR3抗体、Anti-TLR4抗体购自美国Abcam公司，GTVisionTM Ⅲ抗兔/鼠通用型免疫组织化学检测试剂盒购自基因科技(上海)股份有限公司，Nikon ECLIPSE50i显微成像系统购自日本Nikon公司，TS-12A生物组织自动脱水机购自孝感奥华医疗科技有限公司，LEICA SM2400推拉式切片机、LEICA 1210摊片机购自德国Leica公司。

1.3 免疫组织化学法检测肾组织中TLR3和TLR4表达采用免疫组织化学二步法检测肾组织中TLR3和TLR4的表达，具体步骤如下：肾组织常规烤片，脱蜡至水；PBS冲洗3次，每次5 min；柠檬酸盐缓冲液中行抗原修复，高火5 min，中火5 min，冷却至常温；PBS冲洗3次，每次 5 min；过氧化氢清除内源性过氧化物酶15 min，PBS冲洗3次，每次5 min；滴加山羊封闭血清10 min，倾去血清，加入一抗(滴度1100)，于湿盒内4 ℃过夜；复温30 min，PBS冲洗3次，每次 5 min；加入适量二抗，置湿盒内37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min；二氨基联苯胺显色，苏木素复染40 s，流动水冲洗1 min，脱水，封片，光学显微镜下观察。使用正常山羊血清代替一抗进行阴性对照，以PBS液代替一抗作为空白对照。

1.4 免疫组织化学结果判定TLR3阳性表达为细胞核着色，TLR4阳性表达为细胞质着色，TLR3和TLR4阳性表达呈棕黄色或棕褐色。在固定光源亮度和曝光条件下，每张切片随机采集10个高倍镜(×400)视野，采用Nikon ECLIPSE50i显微镜及成像系统(日本Nikon公司)拍照；计数每个高倍视野中TLR3阳性细胞数，并计算TLR3阳性表达率；应用 Image-Pro Plus 图像分析软件分析图像的吸光度值，以吸光度值表示TLR4的相对表达量。

2 结果

3组患儿肾组织中TLR3和TLR4的表达结果见图1和表1。对照组患儿肾小管上皮细胞及肾小球系膜细胞中可见少许TLR3表达，M0组和M1组患儿肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞中TLR3表达明显升高。对照组患儿肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞中TLR4无明显表达；M0、M1组肾小管上皮细胞中TLR4表达明显升高，而肾小球系膜细胞中有少量表达。M1组患儿肾组织中TLR3阳性表达率和TLR4相对表达量显著高于M0组和对照组，M0组患儿肾组织中TLR3阳性表达率和TLR4相对表达量显著高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 3组患儿肾组织中TLR3和TLR4的表达

表1 3组患儿肾组织中TLR3和TLR4表达比较

3 讨论

IgA肾病是儿童常见的原发性肾小球疾病，临床表现多样，目前，IgA肾病的病因和发病机制尚不完全清楚，近年来，越来越多的研究集中在其免疫发病机制方面；然而，先天性免疫细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和一些先天性淋巴细胞对于肾脏免疫稳态是必不可少的，先天性免疫反应提供了由几类模式识别受体引发的宿主防御的第一道防线，如细胞膜结合的TLR等[8]，TLR在免疫应答和炎症反应中起重要作用，而IgA肾病发病前常伴有细菌或病毒感染，细菌或病毒感染之后出现血尿或病情反复。

本研究结果显示，TLR3和TLR4在原发性IgA肾病患儿肾组织中的表达明显增多，且M1组患儿肾组织中TLR3阳性表达率和TLR4相对表达量显著高于M0组，结合前期研究发现TLR3和TLR4在IgA肾病外周血单个核细胞中表达增加[3]，提示TLR与IgA肾病的发生和发展有关。有研究显示，TLR4途径可能通过诱导转录因子如核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)而参与IgA肾病的进展[9]。对IgA肾病大鼠的研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激动剂可通过抑制TLR4的表达和活性而发挥抗炎作用[10]。王缨等[11]研究发现，IgA肾病大鼠肾组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及mRNA的表达均明显上调，同时TLR4表达与MyD88、NF-κB的表达呈正相关。本研究结果显示，TLR4主要表达于肾小管，M1组患儿肾组织中TLR4相对表达量显著高于M0组，提示肾组织中TLR4的表达与系膜增生有关。

有研究显示，TLR3与肾小球肾炎的发展有关，应用人工合成的双链RNA类似物聚肌胞苷酸诱导培养人正常的肾小球系膜细胞，发现人肾小球系膜细胞表达中性粒细胞趋化因子[chemokine (C-X-C motif) ligand 1 protein,CXCL1]，而干扰素-β有助于CXCL1表达，该过程中有TLR3、NF-κB和干扰素调节因子3的参与，同时，IgA肾病肾组织中也发现少量CXCL1表达，提示TLR3信号通路参与了人肾小球系膜细胞表达CXCL1[12]。本研究结果显示，TLR3在IgA肾病患儿肾组织的肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞中表达，且M1组患儿肾组织中TLR3阳性表达率显著高于M0组，提示肾组织中TLR3的表达与系膜增殖有关。聚肌胞苷酸通过TLR3/ B细胞活化因子(B cell-activating factor,BAFF)信号通路，促进IgA肾病患者IgA分泌、IgA类别转换和IgA肾小球沉积，而TLR3和BAFF 小干扰RNA可使分泌型IgA过度表达现象减弱[13]。SAITO等[14]研究显示，IgA肾病患者外周血单个核细胞中TLR3表达量显著高于薄基底膜肾病患者，同时，TLR3 mRNA表达水平与IgA肾病患者尿蛋白排泄量相关。

综上所述，TLR3和TLR4在原发性IgA肾病患儿肾组织中表达明显增多，且M1组患儿肾组织中TLR3和TLR4表达明显高于M0组，提示TLR3和TLR4可能与IgA肾病系膜增殖程度相关。本研究只观察了TLR3和TLR4与系膜增殖情况的关系，未进一步观察TLR3和TLR4与毛细血管内增生性病变、节段性硬化粘连、间质纤维化及小管萎缩等的关系，有待更大样本量的进一步研究。