四种牛结节性皮肤病抗体ELISA检测试剂盒的比对

闭璟珊，赵钟毅，吕 荞，韦正吉，邹联斌，苏姣秀，尹德炜，郑 敏

（1.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 530000；2.广西大学，广西南宁 530004）

牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起的病毒性传染病，也称为牛疙瘩皮肤病、牛结节疹和牛结节性皮肤炎，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[1]。LSDV 具备高度的宿主种属特异性，主要感染牛和水牛，感染后临床主要表现为体温升高、消沉倦怠、淋巴结肿大、产奶量下降，最显著的特征是皮肤（黏膜、器官）表面广泛性结节和水肿。LSDV 还可导致原发和继发性肺炎以及母牛流产，公牛暂时或永久不育，严重影响生产性能和经济价值，对养牛业危害巨大。1929年，赞比亚首次报道发生LSD。1988年LSD 向北传播至埃及和以色列，随后逐渐在亚欧大陆范围内传播[2]。近年来LSD 流行速度加快，2019年8 月我国首次在新疆地区确诊此病[3]。2020年6 月以后，该病在我国多个省份蔓延，给我国养牛业带来了巨大经济损失。

目前，LSD 血清学检测方法主要有病毒中和试验（virus neutralization test，VNT）[4]、间接荧光抗体试验[5]、琼脂凝胶免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[6-7]。VNT 虽然是血清学检测的金标准，其敏感性和特异性分别可达78%和97%，但需要操作活病毒，对实验室条件和操作人员技能要求比较高，也无法满足高通量检测的需要[4]。ELISA 适合高通量检测，且操作简单，是日常检测LSD 的常用方法。有研究[7-9]表明，ELISA 方法检测结果与VNT 检测结果较为一致，可以用于LSD 免疫抗体监测和辅助免疫效果评价。

LSDV与山羊痘病毒（goatpox virus，GPV）、绵羊痘病毒（sheepox virus，SPV）同属于痘病毒科羊痘病毒属（Capripoxvirus）。这几种病毒之间基因组同源性很高[4]，因此许多市售的商品化ELISA 试剂盒可用于上述3 种羊痘病毒属成员抗体检测。根据2020年农业农村部印发的《牛结节性皮肤病防治技术规范》[10]，许多地区对牛进行了5 倍剂量的羊痘疫苗免疫。因此，通过检测羊痘病毒属特异性抗体水平评价牛群的感染情况和免疫效果，对防控LSD 具有重要参考作用。为筛选最为理想的血清抗体检测方法，本研究尝试对4 种市售的商品化LSD 抗体ELISA 检测试剂盒进行分析对比，以期为同行开展LSDV 检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测试剂盒 A、B、C、D 等4 种商品化LSDV 抗体检测试剂盒，由3 个厂家生产，分别购自其代理商。其中A、B 为国外两家企业生产，C、D 为国内某机构研制生产。4 种试剂盒共涉及双抗原夹心法、间接法以及竞争法3 种检测原理。具体信息见表1。

表1 4 种LSDV 抗体ELISA 检测试剂盒检测原理和流程

1.1.2 血清、疫苗、细胞和病毒 LSDV 感染牛血清17 份，采集自广西乐业县、田林县疫点发病黄牛；羊痘疫苗5 倍剂量免疫1 个月后的牛血清36 份，采集自广西百色市右江区黄牛和广西柳州市柳南区荷斯坦奶牛；羊痘疫苗正常剂量免疫1～3个月后的羊血清41 份，采集自广西都安县3 个黑山羊场；阴性牛血清20 份，采集自无LSDV 病史，也未接种羊痘疫苗的健康荷斯坦奶牛群。所有血清均由本实验室采集，并置于-20 ℃保存备用。所接种羊痘疫苗（批号202008），购自哈药集团生物疫苗有限公司；表达绿色荧光蛋白EGFP 的重组山羊痘病毒vTK-Eg，由本实验室构建并保存[11]；原代牛睾丸细胞，由金宇生物技术股份有限公司采用健康未免疫羊痘疫苗的荷斯坦小牛睾丸制备并惠赠，由本实验室液氮保存备用。

1.1.3 仪器设备 全波长酶标仪，购自Tecan 公司；微量移液器，购自Eppendorf 公司；37 ℃普通恒温箱，购自上海福玛公司；细胞培养箱和EVOS FL 细胞成像系统，购自Thermofisher 公司。

1.2 中和抗体检测

114 份血清样本经灭活处理后，利用重组病毒vTK-Eg 采用固定病毒稀释血清法，在原代牛睾丸细胞上测定血清中和抗体。具体试验步骤参照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》进行。

1.3 ELISA 抗体检测

对上述114 份血清样品，分别用4 种ELISA检测试剂盒进行抗体检测。操作步骤和结果判定，均按照相应试剂盒内说明书进行。

1.4 数据处理及分析

以中和试验数据为标准，计算4 种试剂盒的诊断敏感性（diagnostic sensitivity，Dse）、诊断特异性（diagnostic specitivity，Dsp）和符合率（agreement）。诊断敏感性计算公式：Dse=TP/（TP+FN）×100%；诊断特异性：Dsp=TN/（TN+FP）×100%；符合率=（TP+TN）/n×100%。其中，TP 表示真阳性（true positive），FN 表示假阴性（false negative），TN表示真阴性（true negative），FP 表示假阳性（false positive），n为样本数量。进一步采用Kappa 检验评价试剂盒检测结果的一致性，若Kappa 值＜0，则一致性为极差；若Kappa 值为0～0.20，则一致性为微弱；若Kappa 值为0.21～0.40，则一致性为弱；若Kappa 值为0.41～0.60，则一致性为中度；若Kappa 值为0.61～0.80，则一致性为高度；若Kappa 值为0.81～1.00，则一致性为极强。数据处理采用Excel 软件，统计学分析采用SPSS 软件。

2 结果

2.1 重组病毒vTK-Eg 中和抗体检测

荧光显微镜下观察，在未加血清以及加入1:32 稀释的阳性血清细胞孔中可以观察到明亮呈黄绿色的病毒噬斑（图1-A～B）；而加入1:16 以及1:8 稀释的阳性血清细胞孔中观察不到明亮呈黄绿色的病毒噬斑（图1-C～D）。认为阳性血清1:16稀释后已可完全中和重组病毒vTK-Eg，因此将中和抗体大于等于1:16 时判为阳性。

图1 部分血清样品VNT 结果（40×）

2.2 VNT 及ELISA 检测结果统计

VNT 及4 种ELISA 试剂盒对114 份血清的检测结果见表2～3。表2 显示，ELISA 试剂盒检测结果与VNT 检测结果存在一定差异，而且4 种试剂盒检测结果也不完全一致。其中，17 份感染牛血清、36 份免疫牛血清、41 份免疫羊血清和20 份阴性血清，用试剂盒A 分别检出8、15、22 和2 份中和抗体阳性样品；用试剂盒B 分别检出4、7、16 和0 份中和抗体阳性样品；用试剂盒C 分别检出9、24 和0 份中和抗体阳性样品；用试剂盒D 分别检出11、20、14 和0 份中和抗体阳性样品。20 份阴性血清的VNT 检测结果显示全部为阴性，试剂盒B、C、D 的检测结果也全部为阴性，仅有试剂盒A 检出2 份阳性。

表2 VNT 与4 种ELISA 试剂盒检测结果 单位：份

表3 显示，114 份血清中，经VNT 检测为阳性的共有61 份，经试剂盒A 检测为阳性的37 份，试剂盒B 检测为阳性的23 份，试剂盒C 检测为阳性的24 份，试剂盒D 检测为阳性的42 份。

表3 VNT 与4 种ELISA 试剂盒检测结果比较 单位：份

以VNT 结果作为金标准，分别计算4 种试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、符合率和Kappa 值，结果见表4。从诊断特异性看，4 种试剂盒特异性均能达到80%以上，其中试剂盒B 和D 的特异性达到90%以上。从诊断敏感性看，4 种试剂盒的敏感性均低于80%，其中试剂盒B 的敏感性低于40%，试剂盒C 的敏感性略高于70%。从符合率上看，试剂盒C、D 的符合率均达到80%，试剂盒B 的符合率较低，仅为63.16%。

表4 4 种ELISA 试剂盒各项指标评价结果

3 讨论

羊痘病毒感染主要引起细胞免疫，但研究[12-13]发现，无论症状是否明显，从LSDV 自然感染中康复的动物均能产生包括中和抗体在内的特异性抗体，能够中和病毒并对再次感染具有抵抗力。LSD疫情在我国的发生，给养牛业带来了巨大威胁。根据农业农村部印发的《牛结节性皮肤病防治技术规范》[10]要求，疫情所在县和相邻县可采用国家批准的山羊痘疫苗，按山羊的5 倍剂量对全部牛只进行免疫。如何评价免疫牛群的保护性抗体水平，是否可通过监测抗体水平确定LSD 在非免疫牛群中的流行情况，成为LSD 防控工作的重要问题。目前市场上已有多个检测LSD 抗体的ELISA 试剂盒在销售，本研究对其中4 种LSD 抗体ELISA 检测试剂盒进行了评估，力争使检测结果能够充分反映样品的真实情况，体现动物群体的抗体水平，为免疫效果评价及防控策略制定和优化提供数据支持。

根据Kappa 一致性检验结果判定标准，Kappa值越大，两者一致性越高，表明结果的可靠程度就越高。对4 种试剂盒的Kappa 值分析可得出，试剂盒A 与VNT 的一致性为中等，而试剂盒B 的一致性为弱，试剂盒C、D 的一致性为高度。本试验中，4 种试剂盒敏感性均低于80%，诊断特异性均在80%以上，最高达94%。Milovanović 等[9]研究发现，以VNT 结果为金标准，IDVET 公司研发的IDScreen® Capripox double antigen Multi-species ELISA kit 敏感性和特异性分别为91%和87%。而本研究结果与之有较大差距，其原因可能与我国免疫的是国产山羊痘疫苗毒株AV41 而非LSD Neethling 毒株有关，也与国内外动物群体免疫背景不同需重新优化判定标准有关。

值得一提的是，在检测免疫了羊痘疫苗的羊血清时，试剂盒A 的检出率较高；但在检测牛血清（感染牛血清和免疫牛血清）时，试剂盒A、B的检出率都不高。与之相反，试剂盒C、D 在检测牛血清（感染牛血清和免疫牛血清）时检出率较高，而试剂盒C 在检测羊血清时检出率为0（数据未显示）。这可能是不同试剂盒包被的抗原来源和酶标二抗不同，造成样品类型和检测对象的不同所导致。

LSD 于2019年传入我国，尚未有针对该病原的阳性血清[14]，所以只能通过收集临床样品检测抗体水平，以此开展对试剂盒的评估。考虑到生物安全问题，本研究利用了本课题组之前以山羊痘弱毒疫苗毒株AV41 构建的重组山羊痘病毒vTK-Eg进行中和试验。OIE 也推荐用羊痘病毒替代LSDV开展中和抗体测定[7]。该病毒携带EGFP 绿色荧光蛋白，便于在荧光显微镜下观察细胞病变[10]。本研究选取的免疫牛血清采集自羊痘疫苗免疫1 个月后的牛，此时抗体水平尚未上升到高位，样品阳性少、阴性多的检测结果可能对试剂盒的实验结果分析产生影响，使之出现偏差。另外，由于样本数量限制，本次试验并未对试剂盒批次间稳定性进行评价，在实际应用中仍有必要对试剂盒稳定性进行进一步评测。

依据本研究结果，在检测LSD 抗体时，国产试剂盒C、D 在各项评价指标上表现相对较好，而进口试剂盒A、B 可能更适合于其他羊痘病毒属成员抗体检测。结果提示，在开展羊痘病毒属抗体检测时，应根据实际情况合理选择试剂盒，以保证检测结果的准确性。